Redémarrez direct d'une fourche de réplication bloquée par une polymérase ARN Head-On

L'objectif général de cette procédure est d'observer le destin de la zone de réplication et de l'ARN polymérase ou RNAP après une collision frontale. Cela est réalisé en assemblant d'abord le complexe de transcription sur de l'ADN biotinylé et en l'immobilisant sur des comprimés Stripp et des billes, ce qui conduit à un complexe d'élongation de la RNAP arrêté. La deuxième étape de la procédure consiste à ligaturer un ADN fourchu préformé au complexe d'élongation de la RNAP afin de former une fourche de réplication en aval de la RNAP en collision frontale.

La troisième étape de la procédure consiste à assembler la zone de réplication et à initier la synthèse du brin conducteur au niveau de la fourche de réplication. La dernière étape de la procédure consiste à isoler l'ADN à partir des billes magnétiques et à purifier l'ADN sur une colonne de purification pour PCR. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que le roso s'arrête lorsqu'il entre en collision avec le complexe de transcription de sens contraire, grâce à un gel d'agarose alcalin des produits d'ADN marqués au radiolabel purifiés.

Bonjour, je suis Richard Pomerance du laboratoire de Mike O'Donnell à l'Université Rockefeller. Aujourd'hui, je vais vous présenter la procédure permettant de provoquer une collision entre le ribosome et une polymérase ARN en phase solide. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment le processus de réplication est affecté par les complexes de transcription le long de l'ADN.

Commençons. Pour commencer ce protocole, mélangez l'enzyme ARN polymérase holo avec un modèle d'ADN de 3,6 kb biotinylé contenant le promoteur T7A1 dans 100 microlitres de tampon A, puis incubez le mélange pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation de 10 minutes, ajoutez les ribonucléotides adénosine triphosphate, cytidine monophosphate et uridine adénylique, ce qui limitera la synthèse d'ARN à 20 nucléotides.

Incuber la solution pendant 10 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius afin d'immobiliser le complexe d'élongation de l'ARN polymérase arrêté sur des billes. Ajouter la solution à des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Laisser la mixture s'incuber pendant 10 minutes à température ambiante.

Purifiez le complexe d'élongation de l'ARN polymérase immobilisé et arrêté en lavant les billes avec 0,9 millilitre de tampon à haute force ionique. Pour éliminer les complexes R-N-A-P-D-N-A non spécifiques après chaque lavage, retirez le surnageant par séparation magnétique. Ce lavage doit être répété cinq fois.

Ensuite, les billes doivent être lavées deux fois supplémentaires avec 0,9 millilitre de tampon A. Après le dernier lavage, la fourche de réplication en aval peut être assemblée pour former une fourche de réplication en aval du complexe RNAP bloqué en sens direct. Suspendre la bande magnétique avec les billes fixées au complexe d'élongation RNAP arrêté dans 100 microlitres de tampon quatre de New England Biolabs. Ajouter ensuite 10 unités de phosphatase alcaline de crevette (SAP1) et incuber l'échantillon pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Laver les billes trois fois avec 0,9 millilitre de tampon A. Puis resuspendre les billes dans 50 microlitres de tampon de réaction de ligase rapide T4.

Ajoutez deux microlitres de ligase T4 rapide et de l'ADN pré-incisé, puis incubez la solution pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, lavez les billes trois fois supplémentaires avec 0,9 millilitre de tampon A, puis mélangez l'hexamère et l'hélicase DNAB avec les billes magnétiques streptavidine A auxquelles est fixé le complexe d'élongation de l'ARN polymérase arrêté et la fourche de réplication en aval. Préparez la solution dans 150 microlitres de tampon A et incubez-la pendant 30 secondes à 23 degrés Celsius.

Après une courte incubation de 32 secondes à 23 degrés Celsius. Au niveau de la pince de la polymérase trois bêta, ajouter de l'ATP, du dGTP, du dATP, du dGTP marqué au alpha P 32 et du dATP marqué au alpha P 32, pour un volume total de 200 microlitres. Incuber l'échantillon pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Initier la réplication en ajoutant la protéine de liaison à l'ADN simple brin, DCTP et DTTP. Ajouter également du DTTP et du DCTP marqués au alpha P 32 jusqu'à un volume final de 250 microlitres. Après 10 minutes, arrêter les réactions en ajoutant 12 microlitres d'EDTA 0,5 molaire.

Ensuite, faire bouillir les billes dyna pour libérer l'ADN des billes. Éliminer tout résidu d'ADN en traitant les billes avec de la protéinase K pendant 30 minutes à 50 degrés Celsius. Faire de nouveau bouillir les billes et récupérer le surnageant par séparation magnétique.

Purifiez le surnageant combiné contenant l'ADN à l'aide du kit de purification PCR Kyogen. Enfin, analysez les produits d'ADN marqués radioactifs purifiés sur un gel alcalin aros. La collision de la zone avec une ARN polymérase frontale donne généralement deux produits de 2,5 kb et 3,6 kb de longueur. Le produit de 2,5 kb représente la longueur de l'ADN allant de la fourche jusqu'à l'ARN polymérase arrêtée.

Cela résulte d'un blocage de la réplisome lors d'une collision avec la RNAP. Le produit de 3,6 KB représente l'ADN complet et provient soit d'une occupation incomplète du promoteur par la RNAP, soit d'un passage partiel de la réplisome à travers la RNAP en sens contraire. Un bon résultat montre qu'environ 50 % de l'ADN complet est produit.

Cependant, dans certains cas, une occupation moindre du promoteur par l'ARN polymérase se produit et un pourcentage plus élevé d'ADN de taille complète est observé. Cela s'explique par le fait qu'une population plus importante de zones de réplication n'entre pas en collision frontale avec une ARN polymérase en cours de réplication ; en l'absence d'une ARN polymérase arrêtée, cela conduit uniquement à la formation d'ADN de taille complète. Nous venons de vous montrer comment réaliser la réplication en phase solide en présence d'un complexe d'élongation de l'ARN polymérase arrêté lié à l'ADN. Lors de cette procédure, il est important de laver le complexe de transcription arrêté avec une solution saline concentrée afin d'éliminer l'excès d'ARN polymérase, qui se lie non spécifiquement à l'ADN et inhibe la réplication.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.