Name: Redémarrez direct dune fourche de réplication bloquée par une polymérase ARN Head-On (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Découvrez comment observer le destin du réplicome après collision avec l'ARN polymérase en utilisant l'ADN biotinylé et des billes magnétiques. Cette méthode révèle le rôle de Mfd dans le redémarrage de la réplication.

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Nous sommes particulièrement reconnaissants à Seth Darst pour fournir des protéines ARNP et MFD et vecteurs d&#39;expression. Nous sommes également à remercier Sergueï Borukhov pour fournir Greb et Dan Zhang pour le soutien technique. Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (MOD) et par une Marie-Josée et Henry Kravis Fellowship à l&#39;Université Rockefeller (RTP).

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz et O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010)</a> . 1. Assemblée d'un complexe d'élongation a été stoppé ARNP effectuée comme suit: 500 nM de concentration finale de E. ARNP coli σ 70 ans, il a été mélangé avec une concentration de 5 nM final d'une matrice d'ADN biotinylé 3,6 kb contenant le promoteur T7A1 dans 100 ul de tampon A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM de MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycérol) pendant 10 min à 37 ° C. 100 uM de l'APU et 40 uM de chacun de GTP, ATP, et CTP ont été ajoutés pour encore 10 min à 37 ° C. 2. Immobilisation du complexe d'élongation ARNP stoppé sur des billes de streptavidine a été effectuée comme suit: 200 ul de streptavidine billes magnétiques revêtues (Invitrogen) ont été ajoutés à la réaction ci-dessus pendant 10 min à température ambiante. 3. Purification du complexe immobilisé ARNP stoppé l'élongation a été effectuée comme suit: Les perles (en haut) ont été lavées 5 fois avec 0,9 ml de tampon A contenant 0,75 M de NaCl, 200 ug / ml d'héparine, et 20 pg / ml ADNss (Le surnageant a été éliminé après chaque étape de lavage par séparation magnétique.) Ensuite, le billes ont été lavées deux fois avec 0,9 ml de tampon A. 4. Formation d'une fourche de réplication en aval par rapport à la tête sur ARNP a été effectuée comme suit: Les perles (en haut) ont été remises en suspension dans 100 ul de tampon de la Nouvelle Angleterre Biolabs 4 et 10 unités de Sap I (New England Biolabs) a été ajouté pendant 10 min à 37 ° C. Les billes ont été lavées trois fois avec 0,9 ml de tampon A puis remis en suspension dans 50 pl de tampon de ligation réaction rapide T4 (New England Biolabs). 2 pi de ligase T4 rapide (New England Biolabs) a été ajouté avec 6 concentrations nM finale de pré-recuit ADN fourchue (RP10, RP22, RP25) pendant 10 min à température ambiante. Les billes ont été lavées trois fois avec 0,9 ml de tampon A. 5. Assemblée de l'réplisome et l'initiation de la synthèse des brins de premier plan à la fourche de réplication a été effectuée comme suit: 448 pmol de DnaB (comme hexamère) a été incubée avec les 150 perles ul de tampon A (20 mM de glycérol Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM de MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) pendant 30 s à 23 ° C. 4.9 pmol de Pol III * (Pol III, il minus β), 15 pmol de β, ATP 2 mM, et 60 uM chacun de dGTP et dATP ont été ajoutés à un volume de 200 ul et incubée encore 5 min à 37 ° C. La réplication a été lancé lors de l'ajout de 10 mg et SSB 24 uM de chacun de dATP et dTTP avec [α-32 P] dTTP et [α-32 P] dCTP (activité spécifique, 3000-5000 cpm / pmol) pour un volume final de 250 ul. Réactions ont été interrompues au bout de 10 min après addition de 12 ul d'EDTA 500 mM. 6. Purification et la concentration de la radio-labellisés ADN a été effectuée comme suit: Les perles (en haut) ont été cuits après la réaction a été arrêtée afin d'éliminer l'ADN à partir des perles. Toute l'ADN résiduel restant attaché à billes a été éliminé en traitant les perles avec la protéinase K dans un volume de 10 ul pendant 30 min à 50 ° C. Les billes sont ensuite bouillies et le surnageant a été enlevé par séparation magnétique. Le surnageant contenant l'ADN combinée a été purifié en utilisant le kit Qiagen PCR Cleanup. Purifié radiomarqué produits d'ADN ont ensuite été analysés dans un gel d'agarose alcalines. Réplication * en l'absence d'une tête sur ARNP stoppé complexe d'élongation a été effectuée comme ci-dessus, cependant, σ 70 a été omise. Les résultats représentatifs: Collision de l'réplisome avec une tête sur ARNP se traduit généralement par deux produits de 2,5 kb et 3,6 kb de longueur. Le produit de 2,5 kb représente la longueur de l'ADN de la fourche à la ARNP stoppé et les résultats de réplisome décrochage lors d'une collision avec le ARNP. Le produit 3,6 kb représentent pleine longueur de l'ADN et les résultats de l'occupation soit incomplète du promoteur par ARNP ou partielle réplisome lecture par le biais de l'ARNP front. Un bon résultat ou précis démontre qu'environ 50% de la pleine-longueur de l'ADN est produit. Toutefois, dans certains cas, moins d'occupation du promoteur par ARNP se produit et un pourcentage plus élevé de toute la longueur ADN est observée depuis une plus grande population de replisomes ne rencontrent pas une ARNP front. Réplication en l'absence d'un résultat ARNP stoppé en seulement plein longueur de l'ADN (3,6 kb). <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Figure 1"> Figure. 1 Le réplisome est entravée par un ARNP front. (A) Montage expérimental. Un E. Coli ARNP complexe d'élongation arrêté a été assemblé sur un ADN biotinylé contenant le promoteur T7A1 comme décrit précédemment (9). Brièvement, un complexe d'élongation arrêté a été formé 20 bps aval du promoteur en incubant holoenzyme ARNP avec l'ADN biotinylé pendant 10 min suivi par l'ajout d'Apu, le GTP, ATP, CTP et pendant encore 10 min. Billes de streptavidine ont été ajoutés pour encore 10 min puis les billes ont été lavées cinq fois chacune avec 0,9 ml de tampon contenant 0,75 M de NaCl, 200 mg / ml d'héparine, et 100 nM seul brin d'ADN pour retirer instables ARNP complexes ADN-et PNT excès . L'ADN a ensuite été digéré avec Sapi, lavées, et ligué à un ADN pré-recuit fourchue. Les billes ont été lavées à nouveau avant l'assemblage du réplisome. Le promoteur est situé à 2,5 kb de la fourche et est orientée à la transcription directe vers la fourche (B). DnaB a été ajouté puis le réplisome a été assemblé et la réplication a été initié, soit en présence (piste 2) ou l'absence (piste 1) d'un front ARNP.

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
<li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors%3A+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li>
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<li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+RNA+Polymerase+by+%28p%29ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li>
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<li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+repair+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li>
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<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

Le lavage du complexe d&#39;élongation stoppé lié aux billes avec du sel élevée est essentielle afin de supprimer tout instable ou non spécifiquement molécules ARNP lié. ARNP a une affinité extrêmement élevée pour amorce-matrice des structures d&#39;ADN de type. Ainsi, il est nécessaire d&#39;éliminer ces non-spécifiques ARNP complexes ADN-afin d&#39;effectuer la réplication de l&#39;amorce-matrice. La concentration des radio-marqués produits de l&#39;ADN en utilisant le kit de purification de PCR Qiagen est également essentiel afin d&#39;obtenir un signal assez haute radioactives qui peuvent être observées dans le gel.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>ADN ligase T4 rapide</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

redémarrez direct d&#39;une fourche de réplication bloquée par une polymérase arn head-on

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

Des études in vivo suggèrent que fourches de réplication sont arrêtées en raison de rencontres avec la tête sur les complexes de transcription. Pourtant, le sort de la réplisome et l&#39;ARN polymérase (ARNP) suite à une collision frontale est inconnue. Ici, nous constatons que la E. coli stands réplisome lors d&#39;une collision avec une tête sur le complexe de transcription-, mais au lieu de s&#39;effondrer, la fourche de réplication reste très stable et reprend finalement allongement après déplacement de la ARNP partir de l&#39;ADN. Nous constatons aussi que le facteur de couplage transcription-réparation, MFD, favorise redémarrer directe de la fourche après la collision, en facilitant le déplacement de la ARNP. Ces résultats démontrent la stabilité intrinsèque de l&#39;appareil de réplication et un nouveau rôle pour la voie de réparation transcription-réplication couplée à la promotion d&#39;un bloc ARNP dernières.

Le sort de la réplisome suite d&#39;une collision avec une tête sur l&#39;ARN polymérase (ARNP) est inconnu. Nous constatons que les étals réplisome lors d&#39;une collision avec un ARNP de front, mais reprend allongement après déplacement de la ARNP partir de l&#39;ADN. Mfd favorise redémarrer la réplication en facilitant le déplacement de la ARNP après la collision.

Redémarrez direct d&#39;une fourche de réplication bloquée par une polymérase ARN Head-On

Des études in vivo suggèrent que les fourches de réplication sont bloquées lors de rencontres avec des complexes de transcription frontaux. Pourtant, le sort du réplisome et de l'ARN...

L'objectif général de cette procédure est d'observer le sort de la zone de réplication et de l'ARN polymérase ou RNAP après une collision frontale. Cela est réalisé en assemblant d'abord le complexe de transcription sur de l'ADN biotinylé et en l'immobilisant sur des comprimés Stripp et des billes, ce qui conduit à un complexe d'élongation de la RNAP arrêté. La deuxième étape de la procédure consiste à ligaturer un ADN fourchu préformé au complexe d'élongation de la RNAP afin de former un fourcheton de réplication en aval de la RNAP en collision frontale.La troisième étape de la procédure consiste à assembler la zone de réplication et à initier la synthèse du brin conducteur au niveau de la fourche de réplication. La dernière étape de la procédure consiste à isoler l'ADN à partir des billes magnétiques et à purifier l'ADN sur une colonne de purification pour PCR. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant que le roso s'arrête lors d'une collision avec le complexe de transcription de sens contraire, grâce à un gel d'agarose alcalin des produits d'ADN marqués au radioisotope purifiés.Bonjour, je suis Richard Pomerance du laboratoire de Mike O'Donnell à l'Université Rockefeller. Aujourd'hui, je vais vous présenter la procédure permettant de provoquer une collision entre le ribosome et une polymérase ARN en phase solide. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment le processus de réplication est affecté par les complexes de transcription le long de l'ADN.Commençons. Pour commencer ce protocole, mélangez l'enzyme ARN polymérase holo avec un modèle d'ADN de 3,6 kb biotinylé contenant le promoteur T7A1 dans 100 microlitres de tampon A, puis incubez le mélange pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation de 10 minutes, ajoutez les ribonucléotides adénosine triphosphate, cytidine monophosphate et uridine adénylique, ce qui limitera la synthèse d'ARN à 20 nucléotides.Incuber la solution pendant 10 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius afin d'immobiliser le complexe d'élongation de l'ARN polymérase arrêté sur des billes. Ajouter la solution à des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Laisser la mixture s'incuber pendant 10 minutes à température ambiante.Purifiez le complexe d'élongation de l'ARN polymérase immobilisé et arrêté en lavant les billes avec 0,9 millilitre de tampon à haute force ionique. Pour éliminer les complexes R-N-A-P-D-N-A non spécifiques après chaque lavage, retirez le surnageant par séparation magnétique. Ce lavage doit être répété cinq fois.Ensuite, les billes doivent être lavées deux fois supplémentaires avec 0,9 millilitre de tampon A. Après le dernier lavage, la fourche de réplication en aval peut être assemblée pour former une fourche de réplication en aval du complexe RNAP bloqué en sens direct ; suspendre la bande magnétique avec les billes associées au complexe d'élongation RNAP arrêté dans 100 microlitres de tampon quatre de New England Biolabs. Ajouter ensuite 10 unités de phosphatase alcaline de crevette (SAP1) et incuber l'échantillon pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Laver les billes trois fois avec 0,9 millilitre de tampon A. Puis resuspendre les billes dans 50 microlitres de tampon de réaction de ligase T4 rapide.Ajoutez deux microlitres de ligase T4 rapide et de l'ADN pré-incisé ramifié, puis incubez la solution pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, lavez les billes trois fois supplémentaires avec 0,9 millilitre de tampon A, puis mélangez l'hexamère, l'hélicase DNAB avec les billes de streptavidine magnétiques auxquelles est fixé le complexe d'élongation de l'ARN polymérase arrêté et la fourche de réplication en aval. Préparez la solution dans 150 microlitres de tampon A et incubez-la pendant 30 secondes à 23 degrés Celsius.Après une courte incubation de 32 secondes à 23 degrés Celsius. Ajouter à la polymérase trois béta clamp, de l'ATP, du dGTP, du dATP, du dGTP marqué au alpha P 32 et du dATP marqué au alpha P 32, jusqu'à un volume de 200 microlitres. Incuber l'échantillon pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Initier la réplication en ajoutant la protéine de liaison à l'ADN simple brin, DCTP et DTTP. Ajouter également du DTTP et du DCTP marqués au alpha P 32 jusqu'à un volume final de 250 microlitres. Après 10 minutes, arrêter les réactions en ajoutant 12 microlitres d'EDTA 0,5 molaire.Ensuite, faire bouillir les billes dyna pour libérer l'ADN des billes. Éliminer tout ADN résiduel en traitant les billes avec de la protéinase K pendant 30 minutes à 50 degrés Celsius. Faire de nouveau bouillir les billes et récupérer le surnageant par séparation magnétique.Purifiez le surnageant combiné contenant l'ADN à l'aide du kit de purification PCR Kyogen. Enfin, analysez les produits d'ADN marqués radioactifs purifiés sur un gel alcalin aros. La collision de la zone avec une RNAP frontale donne généralement deux produits de 2,5 kb et 3,6 kb de longueur. Le produit de 2,5 kb représente la longueur de l'ADN allant de la fourche jusqu'à la RNAP arrêtée.Cela résulte d'un blocage de la réplisome lors d'une collision avec la RNAP. Le produit de 3,6 KB représente l'ADN complet et provient soit d'une occupation incomplète du promoteur par la RNAP, soit d'un passage partiel de la réplisome à travers la RNAP en sens contraire. Un bon résultat montre qu'environ 50 % de l'ADN complet est produit.Cependant, dans certains cas, une occupation moindre du promoteur par l'ARN polymérase se produit et un pourcentage plus élevé d'ADN de taille complète est observé. Cela s'explique par le fait qu'une population plus importante de zones de réplication n'entre pas en collision frontale avec une ARN polymérase en cours de réplication ; en l'absence d'une ARN polymérase arrêtée, cela conduit uniquement à la formation d'ADN de taille complète. Nous venons de vous montrer comment réaliser la réplication en phase solide en présence d'un complexe d'élongation de l'ARN polymérase arrêté lié à l'ADN. Lors de cette procédure, il est important de laver le complexe de transcription arrêté avec une solution saline concentrée afin d'éliminer l'excès d'ARN polymérase, qui se lie non spécifiquement à l'ADN et inhibe la réplication.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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