Mesurer le complément hémolytique 50% (CH ₅₀) Activité de Sérum

Mesure de l'activité du complément hémolytique à 50 % (CH 50) du sérum. Vous aurez besoin d'une pipette capable de délivrer 200 microlitres et d'une autre pouvant délivrer 1000 microlitres, du sérum test, qui a été conservé sur glace, des globules rouges de mouton sensibilisés, du chlorure de sodium tamponné au veronal et de l'eau distillée, des tubes pour le test, monsieur, ainsi que des tubes pour la ligne de base et la lyse totale, un vortexeur et une plaque à 96 puits à fond plat. Étiquetez individuellement les tubes avec le contrôle et la dilution finale. Dans ce cas, nous commençons par une dilution au 1/8.

Procédez à des dilutions au double, permettant d'obtenir des dilutions d'un sur 16, un sur 32, un sur 64 et un sur 128, puis étiquetez les tubes restants « blanc » et « lyse totale ». Une fois tous les tubes étiquetés, vous pouvez désormais commencer à diluer votre sérum test. Commencez par transférer 300 microlitres de tampon salin R dans un tube neuf.

Transférez maintenant 100 microlitres de sérum dans 300 microlitres de solution saline R. Cela vous donnera une dilution initiale au quart. Assurez-vous que l'échantillon de sérum est bien mélangé.

Transférez maintenant 200 microlitres de solution saline tamponnée au tube qui ont été étiquetés précédemment. Ajoutez également 200 microlitres de solution saline tamponnée au tube aux deux tubes témoins, en plus des tubes de lyse totale. Ajoutez 200 microlitres d'eau distillée, et non de la solution saline tamponnée Verona.

Transférez maintenant 200 microlitres du sérum dilué au 1/4 dans le tube étiqueté 1/8. Nous avons précédemment transféré 200 microlitres de tampon salin dans les tubes étiquetés du 1/8 au 1/1024 selon une série de dilutions. Ceci donnera désormais une dilution au 1/8.

Mélangez bien l'échantillon, puis transférez 200 microlitres dans le tube étiqueté un sur 16. Poursuivez jusqu'à ce que toute la série de tubes ait été diluée. Jetez 200 microlitres de la dilution un sur 128 afin que le volume final soit de 200 microlitres.

Les globules rouges de mouton sensibilisés peuvent s'être déposés avec le temps. Ils devront être remis en suspension par retournement doux du tube plusieurs fois. Une fois correctement remis en suspension, transférez 200 microlitres des globules rouges de mouton sensibilisés dans chacun des tubes préparés.

Veillez à ce que le sérum soit soigneusement mélangé avec les globules rouges. Les globules rouges de mouton sensibilisés ajoutés au tube témoin vous permettront de déterminer la lyse spontanée, tandis que le sang ajouté au tube de lyse totale vous permettra de déterminer la valeur à 100 % ; utilisez un vortex réglé sur une vitesse basse pour mélanger délicatement chacun des tubes. Placez ensuite les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez pendant 30 minutes.

Après 15 minutes, vortexer doucement les tubes une fois de plus et incuber pendant encore 15 minutes. Après l'incubation, transférer les tubes dans une centrifugeuse réglée à quatre degrés Celsius et centrifuger à 1500 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, retirer soigneusement les tubes et les placer dans un support adapté. Vous observerez alors le culot de globules rouges, tandis que le SNA apparaît rouge.

En raison de la libération de l'hémoglobine, ajouter 100 microlitres d'eau distillée dans le nombre requis de puits d'une plaque à fond plat de neuf à six puits. En prenant soin d'éviter le culot, transférer 100 microlitres du surnageant S dans le puits approprié de la plaque à six puits. Une fois tous les échantillons chargés sur la plaque, mesurer l'absorption à l'aide d'un spectrophotomètre de plaque réglé à 540 nanomètres.

Ici, nous présentons les données brutes d'absorption pour les deux réplicats. A un et B un. Se référer à la dilution un sur huit.

Ensuite, nous avons les données pour les dilutions une sur 16, une sur 32, une sur 64, et une sur 128. Les puits A6 et B6 sont les témoins blancs. Tandis que les puits A7 et B7 correspondent à la lyse totale.

Une fois les données recueillies, vous devez calculer l'absorption moyenne pour chaque échantillon en double. Ensuite, soustrayez l'absorbance du témoin, qui correspond à la lyse spontanée, de tous les échantillons. Une fois toutes les données recueillies, vous pouvez maintenant calculer le pourcentage de lyse pour chaque dilution en utilisant la formule suivante.

Une fois toutes les données calculées, tracez le pourcentage de lyse sur l'axe vertical en fonction de la dilution du sérum sur l'axe horizontal. Le graphique obtenu peut ensuite être utilisé pour déterminer la dilution du sérum nécessaire pour lyser 50 % des globules rouges sensibilisés. Ce graphique représente le pourcentage de lyse en fonction du facteur de dilution du sérum.

Une ligne peut alors être tracée à partir de 50 % de lyse jusqu'à ce qu'elle croise la courbe. Au point d'intersection avec la courbe, une ligne verticale est abaissée jusqu'à l'axe horizontal. Cette valeur représente le facteur de dilution auquel le sérum doit être dilué pour assurer 50 % de lyse. Lors de la comparaison de deux échantillons de sérum afin de déterminer s'il existe une différence dans le CH 50, la dilution qui fournit 50 % de lyse peut être utilisée comme mesure.