Name: Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Apprenez à profiler l'expression génique spécifique aux types cellulaires dans Arabidopsis thaliana en utilisant le tri cellulaire assisté par fluorescence. Cette méthode permet d'étudier les réponses phytochrome tissu-spécifiques.

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Le travail dans le laboratoire de Montgomery sur les réponses phytochrome dans les plantes est soutenue par la National Science Foundation (subvention aucune. MCB-0919100 au BLM) et les sciences chimiques, sciences de la terre et les sciences biologiques, Bureau des sciences fondamentales de l&#39;énergie, Bureau des sciences, Département américain de Energie (subvention aucune. DE FG02 91ER20021 au BLM). Nous tenons à remercier Melissa Whitaker pour l&#39;assistance technique pendant le tournage et la lecture critique du manuscrit, Stéphanie Costigan à l&#39;aide d&#39;expérimentation, le Dr Louis roi de l&#39;aide pour développer et optimiser Fluorescence-Activated tri cellulaire protocoles pour le tri des protoplastes d&#39;Arabidopsis et le Dr Melinda cadre de l&#39;aide pour confocale microscopie. Nous tenons à remercier Marlene Cameron pour l&#39;assistance de conception graphique et Bird Karen pour son assistance éditoriale.

1. Croissance des végétaux <ol><li> Confirmé UAS-GAL4 BVR X-GFP ligne de trappe enhancer isolée comme décrit 4 (Résumé, voir fig. 1) et les lignes de type sauvage ou parental sont semées sur le sol, soit ~ 2000 graines stérilisées par ligne. </li><li> Les plantes sont cultivées pendant 5 semaines sur le sol sous un éclairage blanc de 100 μmolm -2 s -1 à 22 ° C et une humidité de 70%. </li></ol> 2. Feuille de protoplastes Isolement (adapté de Denecke et Vitale 9) <ol><li> Pour isoler des protoplastes, préparer TEX tampon. Pour 1 litre TEX tampon, pesez les éléments suivants: 3.1 sels g B5 de Gamborg, 0,5 g 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES, 2,56 mM), 0,75 dihydraté g de chlorure de calcium (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mM), 0,25 g de nitrate d'ammonium (NH 4 NO 3, 3,12 mM), 136,9 g de saccharose (0,4 M). Dissoudre les composants complètement en ~ 900 ml d'déminéralisée, eau distillée (FD 2 O) et amener le pH à 5,7 avec une M KOH. Amener le volume final à 1 litre et stériliser par filtration avec une bouteille de 0,2 um-dessus du filtre relié à une pompe à vide. </li><li> Recueillir vert, feuilles saines à partir de plantes (~ 250 ml de feuilles tassées dans un bécher) et rincer avec ~ 40 ml ddH 2 O 4 fois, suivi d'un rinçage à deux reprises avec deux stériles O. ddH L'utilisation d'un bistouri n ° 20, les feuilles coupées en fines lanières et diviser les tissus également en deux tubes de 50 ml en plastique stérile. Préparer 1x mélange de digestion des feuilles en ajoutant 5 ml de solution aliquote de la feuille d'actions 10x digestion (10x solution stock de feuilles de digestion: dissoudre 2% p / v Macerozyme R-10, 4% p / v cellulase "Onozuka" R-10 dans TEX tampon, stériliser par filtration avec filtre de 0,2 um et congeler des aliquotes de 5 ml à -80 ° C) à 45 ml TEX tampon frais. Ajouter ~ 25 ml de mélange de la digestion 1x feuille par tube de 50 ml de couvrir tous les tissus de la feuille. </li><li> Vide d'infiltrer les tissus foliaires au mélange de digestion dans des tubes ouverts pendant 1 heure à température ambiante en utilisant un dessiccateur à vide reliée à une pompe d'eau suivie de 3 heures d'incubation à température ambiante sur une bascule en agitant doucement. Tubes plafonné aux tissus de la feuille dans le mélange de feuilles de digestion 1x sont conservées enveloppées dans du papier aluminium pendant ce processus pour prévenir l'exposition à la lumière. </li><li> Après 3 heures, augmenter la vitesse de bascule pour ~ 2 minutes pour libérer protoplastes. Filtrer la suspension de protoplastes brut par deux couches de toile à fromage stérile pour enlever les débris et recueillir le filtrat dans un bécher de verre stérile. Filtrer le filtrat à travers une maille de nylon de 100 um stérile dans une boîte de Pétri stérile. Recueillir le débit à travers et le transférer sur un nouveau tube stérile de 50 ml. Utilisez environ 15-20 ml de tampon frais TEX pour laver les boîtes de Pétri stériles et de recueillir toute protoplastes adhérant à la surface. </li><li> Centrifuger le débit à travers l'aide d'un rotor à godets swing au 100xg à 10 ° C pendant 15 min (accélération 6, la décélération 0). </li><li> Retirer ~ 25 - 30 ml de liquide sous la couche de protoplastes flottant, qui contient des débris résiduels et granulés, avec une solution stérile 9 "pipette Pasteur en verre relié à une pompe péristaltique sans déranger la couche de protoplastes flottant et laissant ~ 10 - volume de 15 ml. </li><li> Ajouter frais de tampon TEX à un volume final de 40 ml tout en douceur remise en suspension des protoplastes. </li><li> Répétez les étapes 2.5 à 2.7 deux fois pour enlever autant de débris cellulaires que possible. Le temps de centrifugation est réduit à 10 minutes dans la première répétition et à 5 minutes dans la répétition finale. </li><li> Aspirer protoplastes flottant avec une coupe, une pipette de transfert stérile ml dans un nouveau tube de 15 ml. Passez directement au tri ou de stocker dans l'obscurité pendant 2 heures à 4 ° C jusqu'à ce que le tri. </li></ol> 3. Tri protoplastes par le tri de cellules à fluorescence (FACS) <ol><li> Avant le tri, d'examiner les protoplastes par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) en utilisant un laser 488-nm pour l'excitation de confirmer l'intégrité des protoplastes et la présence de fluorescence de la GFP dans la piscine de protoplastes. Les débris minimale est nécessaire pour éviter le colmatage de la buse de tri FACS. </li><li> Trier protoplastes isolés dans TEX tampon par FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) en utilisant une buse de 200 um sur une tête tri macro au taux d'événements entre 6000 et 15000, avec une pression du système d'environ 9 psi suite d'un protocole adapté 10. </li><li> Wild-type non-GFP protoplastes sont utilisés pour déterminer les seuils d'autofluorescence. </li><li> Pour collecter des GFP-positives protoplastes, les cellules de tri en utilisant un refroidissement par air au laser argon (Spectra Physics Modèle 177, Newport Corporation, Irvine, CA) a fonctionné à 100 mW sur une ligne de 488 nm d'argon pour identifier fluorescence de la GFP en utilisant une bande 530/30 Filtre passe. </li><li> Après la collecte de la GFP-positives protoplastes, examiner protoplastes triés par CLSM comme détaillé dans l'étape 3.1. </li><li> Extrait d'ARN total à partir de protoplastes triés en utilisant un Qiagen RNeasy Mini Kit végétales. ADNc peuvent alors être préparés à l'hybridation comme décrit dans Affymetrix GeneChip ExprManuel d'analyse ession Technique puis hybridées à ATH1 Arabidopsis Affymetrix génome entier. </li></ol> Les résultats représentatifs Nous avons détecté un nombre important de cellules positives pour la GFP dans le canal de la GFP par FACS (Fig. 2). Dans des essais d'optimisation utilisant la GFP enhancer-trap les parents, les constitutivement exprimant la GFP en ligne, J0571, affiché ~ 17% à 24% GFP-positives protoplastes, alors que la ligne avec une expression vasculaire et cutanée, J1071, avait ~ 1,4% GFP-positives protoplastes (Tableau 1). Tri de 3 x 500 pi (~ 1,5 ml au total de suspension de protoplastes) de J0571 protoplastes pendant 1 h ~ a donné 100 000 GFP-positives protoplastes. Tri de 3 x 500 pi (~ 1,5 ml de suspension de protoplastes total) de J1071 protoplastes pendant 1,5 h ~ 3000 a donné GFP-positives protoplastes. Images confocale indique un rendement très élevé de protoplastes pour les échantillons à la fois J0571 et J1071 avant le tri a été effectué (Fig. 3C et 3E), et les fractions triées ne contenait que brillante fluorescente GFP-protoplastes (Fig. 3G et données non présentées). Cette constatation confirme que intacte GFP-positives protoplastes peuvent être triées par FACS. Les protoplastes non-GFP peuvent également être triés et collectés dans un canal séparé. Les protoplastes non-GFP servir un contrôle idéal négatif pour des analyses ultérieures puces pour détecter les changements spécifiques dans l'expression des gènes lors de la réduction des niveaux holophytochrome. L'extraction d'ARN à partir de protoplastes isolés (1 ml) d'ARN rendements en quantité suffisante pour la détection par fluorospectrometry (fig. 4). ARN isolé a été évaluée en utilisant un instrument NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) et quantifiés par NanoDrop 3.7.1 logiciel de quantification d'ARN. Rendements d'ARN à partir de pré-triés C24 de type sauvage protoplastes ou FACS-triés, GFP-positives protoplastes piège enhancer dépassé le minimum de 20 ng nécessaires pour une utilisation dans l'ARN-étiquetage des dosages pour biopuces (tableau 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Enhancer Piège Ligne </td><td> % De la GFP-positives protoplastes </td><td> Nombre de protoplastes GFP triés </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17,18% 24,06% ~ </td><td> 26400 ~ 36000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1,43% </td><td> 1000 ~ 1300 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Pourcentage de la GFP-positives protoplastes à partir de deux lignes de trappe Enhancer avant le tri et le nombre de GFP-positives protoplastes collectées en exécutant 500 pl de suspension de protoplastes à travers le trieur de cellules activé par fluorescence (FACSVantage, BD). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Ligne des végétaux </td><td> ARN rendement (ng) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486.5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71,5 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Rendement de l'isolement d'ARN à partir de protoplastes. L'ARN a été isolé à partir de pré-triés C24 de type sauvage ou triés GFP-positives protoplastes à partir de deux lignes de trappe enhancer et quantifiés. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. GAL4 enhancer-trap à base d'induction de biliverdine réductase (BVR) expression dans des plantes transgéniques d'Arabidopsis thaliana. (A). Une personne choisie parmi une bibliothèque de base de GAL4 lignes de trappe enhancer, qui contiennent un gène GAL4-réactive GFP marqueur, peut être traversé par une ligne contenant un gène cible GAL4-réactive pour induire l'expression du gène cible dans GAL4 contenant les cellules marquées par fluorescence de la GFP. Basé sur un personnage du Dr Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Production de phytochrome chromophore, phytochromobilin (PΦB) et holophytochrome de lignées parentales. (C) A gauche, la réduction de la biliverdine IXα (BV IXα) et par la biliverdine réductase PΦB (BVR) des activités à BR et PΦR, respectivement. Résultats de l'activité dans le BVR épuisement des PΦB et conduit à une réduction de la production de photoactifs holophytochrome. A droite, la réaction catalysée par BVR est montré. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Fluorescence tri cellulaire (FACS) parcelles de points d'acquisition. Comparaison des cellules protoplastes de tri pour C24 de type sauvage (A), J0571 (B) et J1071 (C). (A) dot plot Acquisition de non-GFP fluorescente C24 de type sauvage protoplastes excité par un laser 488-nm argon et utilisé pour déterminer le seuil d'autofluorescence. (B) et (C) l'acquisition des parcelles de points montrent des proportions de protoplastes qui sont GFP-positives en réponse à une excitation par un laser 488-nm. R3 portes de tri dans B et C délimiter les cibles GFP-positives qui ont été triés par trieur de cellules activées par fluorescence (FACSVantage, BD) et collectées. Canal rouge indique valeurs pour autofluorescence chlorophylle à partir de protoplastes et canal vert indique les valeurs pour fluorescence de la GFP. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Microscopie confocale des protoplastes de plantes utilisées pour le tri cellulaire. Confocale laser, les images numérisées avant de protoplastes (A, C, E) et après (G) le tri par trieur de cellules activées par fluorescence (FACS). B, D, F et H sont des images DIC. Protoplastes de C24 de type sauvage (A, B), J1071 (C, D) et J0571 (E, F, G, H) sont représentés. Images C, E et G sont fusionnés images de fluorescence de la GFP (BP 505 nm - 575 nm) et autofluorescence (LP 650 nm) obtenus à partir d'excitation avec un laser 488-nm. A à H sont en moyenne de 4 scans dans l'huile 63x. Barre = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Quantification de l'ARN isolé à partir de protoplastes par fluorospectrometry. L'ARN extrait à partir de (A) C24 de type sauvage, (B) J0571, et (C) J1071. A indique l'ARN pré-triés de type sauvage protoplastes. B et C indiquent ARN à partir de la GFP-positives protoplastes triés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Un logiciel de quantification d'ARN, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

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</ol>

Profilage de l&#39;expression de gènes par puces à ADN (1) a indiqué que plus de 30% des gènes dans des plants d&#39;Arabidopsis sont réglementés et de lumière 11 (2) a identifié un vaste groupe de gènes codant des protéines de transduction du signal lumineux impliqués dans la cascade de signalisation phytochrome 12, 13 . De telles expériences suggèrent que la lumière induit des changements rapides et à long terme dans l&#39;expression des gènes. Chaque pool de phytochromes peut contrôler une parti...

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-BVR</td><td>QED Bioscience Inc.</td><td>56257-100</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase &amp;#8220;Onozuka&amp;#8221; R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>MSPC 0930</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de sels basiques B5 de Gamborg&amp;rsquo;s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5768</td><td></td></tr><tr><td>Macérozyme R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>PTC 001</td><td></td></tr><tr><td>MES, faible teneur en humidité</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Sels de Murashige et Skoog</td><td>Caisson Laboratories</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>Phytablend</td><td>Caisson Laboratories</td><td>28302</td><td></td></tr><tr><td>Kit Minikit RNeasy pour plantes</td><td>Qiagen</td><td>16419</td><td></td></tr></tbody></table>

Étude des tissus et des organes spécifiques réponses phytochrome utilisant facs assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans arabidopsis thaliana</em

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Médie lumière un éventail de processus de développement et d&#39;adaptation tout au long du cycle de vie d&#39;une plante. Les plantes utilisent la lumière d&#39;absorption des molécules appelées photorécepteurs de détecter et de s&#39;adapter à la lumière. Le rouge / rouge lointain absorbant la lumière photorécepteurs phytochrome ont été largement étudiés. Phytochromes exister comme une famille de protéines ayant des fonctions distinctes et qui se chevauchent dans tous les systèmes de plantes supérieures dans lesquelles ils ont été étudiés<sup&gt; 1</sup&gt;. Réponses lumière phytochrome médiation, qui vont de la germination des graines grâce à la floraison et la sénescence, sont souvent localisées dans les tissus des plantes ou des organes<sup&gt; 2</sup&gt;. Malgré la découverte et l&#39;élucidation de l&#39;individu et redondants fonctions phytochrome par des analyses de mutation, des rapports concluants sur des sites distincts de photoperception et les mécanismes moléculaires de piscines localisées de phytochromes qui interviennent dans l&#39;espace des réponses spécifiques phytochrome sont limitées. Nous avons conçu des expériences basées sur l&#39;hypothèse que des sites spécifiques du phytochrome photoperception réguler les tissus et les organes aspects spécifiques de la photomorphogenèse, et que les piscines localisées phytochrome s&#39;engager sous-ensembles distincts de gènes cibles en aval de la cellule à cellule de signalisation. Nous avons développé une approche biochimique pour réduire sélectivement phytochromes fonctionnelle dans un organe ou un tissu-spécifique de façon sein des plantes transgéniques. Nos études sont basées sur un bipartites enhancer-trap démarche qui aboutit à la transactivation de l&#39;expression d&#39;un gène sous le contrôle de la séquence d&#39;activation en amont (UAS) élément par l&#39;activateur transcriptionnel GAL4<sup&gt; 3</sup&gt;. La biliverdine réductase (<em&gt; BVR</em&gt; Gène) sous le contrôle de la SAMU est silencieusement maintenu en l&#39;absence de transactivation de GAL4 dans la relation parent-UAS BVR<sup&gt; 4</sup&gt;. Croisements génétiques entre une ligne SAMU-BVR transgéniques et un résultat GAL4-GFP enhancer ligne de trappe dans l&#39;expression spécifique de la<em&gt; BVR</emGénique&gt; dans les cellules marquées par<em&gt; GFP</em&gt; Expression<sup&gt; 4</sup&gt;. L&#39;accumulation BVR dans les résultats des plantes d&#39;Arabidopsis en carence chromophore phytochrome<em&gt; In planta</em<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Ainsi, les plantes transgéniques que nous avons produit la pièce GAL4-dépendante l&#39;activation de la<em&gt; BVR</emGénique&gt;, ce qui entraîne l&#39;inactivation biochimique du phytochrome, ainsi que GAL4-dépendant<em&gt; GFP</em&gt; Expression. Photobiologiques et des analyses génétiques moléculaires de<em&gt; BVR</em&gt; Lignées transgéniques qui nous donnent des tissus et des organes spécifiques phytochrome réponses à médiation qui ont été associés avec les sites correspondants de photoperception<sup&gt; 4, 7, 8</sup&gt;. Fluorescence tri cellulaire (FACS) de la GFP-positives, enhancer-trap-induite<em&gt; BVR</emProtoplastes végétaux&gt; exprimant couplé avec un type de cellule spécifique profilage de l&#39;expression de gènes par l&#39;analyse des microréseaux est utilisé pour identifier les gènes putatifs cible en aval impliquées dans la médiation spatiale des réponses spécifiques phytochrome. Cette recherche est l&#39;expansion de notre compréhension des sites de perception de la lumière, les mécanismes par lesquels les différents tissus ou d&#39;organes coopèrent dans la croissance des plantes lumière réglementés et le développement, et de faire progresser la dissection moléculaire des complexes phytochrome médiation de cellule à cellule cascades de signalisation.

La base moléculaire de l&#39;espace des réponses spécifiques phytochrome est étudiée en utilisant des plantes transgéniques qui présentent des tissus et des organes spécifiques déficiences phytochrome. L&#39;isolement des cellules spécifiques présentant induite par la déplétion chromophore phytochrome Fluorescence-Activated tri cellulaire suivie par des analyses microarray est utilisée pour identifier les gènes impliqués dans les réponses phytochrome spatiale spécifique.

Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana</em

La lumière médie un ensemble de processus développementaux et adaptatifs tout au long du cycle de vie d'une plante. Les plantes utilisent des molécules absorbant la lumière appelées...

Pour examiner les réponses des phytochromes dans des types cellulaires végétaux spécifiques. Le piège à activateur GAL4-GFP et les lignées transgéniques U-A-S-B-V-R sont croisés afin de produire des plantes déficientes en phytochrome. Des protoplastes foliaires issus de la descendance U-A-S-B-V-R croisée avec GA4-GFP sont isolés à partir de plantes.Ensuite, les protoplastes sont triés selon des critères permettant d'isoler séparément les protoplastes négatifs pour la GFP et les protoplastes positifs pour la GFP ; les protoplastes isolés sont ensuite analysés par microscopie confocale à balayage laser. Afin de confirmer la collecte des protoplastes positifs pour la GFP, l'ARN est extrait des protoplastes et analysé de manière spectrale. Bonjour, je suis Sanka Pivar du laboratoire de BARDA Montgomery au Département de recherche végétale sur l'énergie du Laboratoire national de recherche végétale de l'Université d'État du Michigan.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement de protoplastes foliaires à partir d'une plante ANA pour le tri cellulaire assisté par fluorescence et l'analyse de l'expression génique spécifique à un type cellulaire. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les réponses dépendantes des phytochromes spécifiques aux tissus et aux organes. Commençons donc.La lignée ANA d'Arabidopsis utilisée dans cette procédure a été obtenue par une approche bipartite de piégeage d'enhanceur. L'un provient d'une bibliothèque de lignées de piégeage d'enhanceur présentant différents patrons d'expression de gal ou d'expression. Le parent un exprime également la GFP sous le contrôle d'une séquence d'activation en amont ou UAS.En résumé, le facteur de transcription GA four active tout gène placé sous le contrôle de l'UAS. Dans la lignée parentale un, GA four active GFP ; le parent un a été croisé avec le parent deux. Chez le parent deux, le gène BVR est sous le contrôle de GAL four via l'UAS.La lignée issue du croisement est U-A-S-B-V-R croisée avec G 4G FP. Chez les lignées parentales, la biosynthèse du chromophore phytochrome quatre s'effectue à partir d'un LA, puis de l'hème, jusqu'au biver, abrégé en bv. Mais chez la descendance, le produit du gène BVR bloque la biogenèse du chromophore phytochrome en réduisant le précurseur BV. Cette lignée de descendance BVR, confirmée comme piège à enhanceurs, peut être utilisée pour examiner comment une réduction des niveaux de phytochrome actif affecte différents tissus végétaux.Commencez cette procédure en préparant le sol et les pots pour la culture de plantes afin de générer des protoplastes foliaires. Stérilisez environ 2000 graines par échantillon et par expérience sur du sol dans des pots. Ajoutez de l'eau au fond du plateau contenant les pots et recouvrez entièrement le plateau d'une pellicule plastique.Faire pousser les plantes pendant cinq semaines sous éclairage blanc à 22 degrés Celsius et 70 % d'humidité. Après les cinq à six premiers jours, la germination des graines est confirmée et l'emballage plastique est retiré du plateau. Afin d'isoler les protoplastes, préparer d'abord le tampon TEX : pour un litre de tampon, peser les sels GA's B, le MES, le chlorure de calcium, le nitrate d'ammonium et le saccharose.Dissoudre complètement les composants dans environ 900 millilitres d'eau distillée désionisée, abrégée DD H2O, et ajuster le pH à 5,7 à l'aide de KOH 1 M. Porter ensuite le volume final à un litre et stériliser par filtration.Ensuite, prélevez des feuilles saines et vertes sur les plantes. Rassemblez environ 250 millilitres de feuilles légèrement tassées dans un bécher. Rincez les feuilles avec 40 millilitres d'eau.DD H2O quatre fois, puis rincer deux fois avec du DD H2O stérile à l’aide d’un scalpel numéro 20. Couper les feuilles en fines lamelles et répartir équitablement le tissu dans deux tubes en plastique stériles de 50. Un volume x de mélange de digestion des feuilles est préparé en ajoutant un aliquot de cinq millilitres de solution mère 10 x, préparée en dissolvant 2 % poids par volume de mazy R 10 et 4 % poids par volume de cellulase on azua R 10 dans du tampon TEX, à 45 millilitres de tampon TEX frais.Ajoutez environ 25 millilitres d'une digestion de feuille à 1 x. Mélangez avec les bandes de feuilles dans chaque tube afin que tous les tissus foliaires soient recouverts. Procédez ensuite à la mise sous vide, puis à l'infiltration du tissu foliaire dans la solution de digestion.Mélanger dans des tubes ouverts pendant une heure à température ambiante à l’aide d’un dessiccateur sous vide relié à une pompe à eau. Garder les tubes contenant le tissu foliaire et le mélange de digestion foliaire enveloppés dans du papier d’aluminium afin d’éviter toute exposition à la lumière. Poursuivre par une incubation de trois heures à température ambiante sur un agitateur rotatif avec agitation douce.Après trois heures, augmentez la vitesse d'oscillation pendant deux minutes afin de libérer les protoplastes. Filtrez la suspension brute de protoplastes à travers deux couches de gaze stérile pour éliminer les débris et recueillir le filtrat dans un bécher en verre stérile. Filtrez ensuite le filtrat à travers un tamis en nylon stérile de 100 micromètres dans une boîte de Pétri stérile.Recueillir l'écoulement et le transférer dans un nouveau tube stérile de 50 millilitres. Utiliser environ 15 à millilitres de tampon TEX frais pour laver la boîte de Pétri stérile et récupérer les protoplastes éventuellement présents à la surface. Centrifuger l'écoulement à 100 fois la gravité à 10 degrés Celsius pendant 15 minutes à l'aide d'une centrifugeuse à godets oscillants, avec une accélération réglée à six et une décélération à zéro lorsque la centrifugation est terminée.Utilisez une pipette en verre stérile de neuf pouces reliée à une pompe péristaltique pour éliminer environ 25 à 30 millilitres du liquide situé sous la couche de protoplastes flottants, qui contient les débris résiduels et pelletés, sans perturber la couche de protoplastes flottants, en laissant environ 10 à 50 millilitres. Après avoir éliminé les débris pelletés, ajoutez du tampon TEX frais jusqu'à un volume final de 40 millilitres. Tout en resuspendant délicatement les protoplastes, répétez l'élimination des débris et la resuspension des protoplastes flottants restants.Deux fois supplémentaires afin d'éliminer le plus possible les débris cellulaires D. La durée de centrifugation est réduite à 10 minutes lors de la première répétition et à cinq minutes lors de la dernière répétition. Enfin, utilisez une pipette de transfert stérile de un millilitre pour aspirer les protoplastes en suspension et les transférer dans un nouveau tube de 15 millilitres.Passez directement au tri avant le tri. Examinez les protoplastes par microscopie à balayage laser confocal ou CLSM, en bref, en utilisant un laser de 488 nanomètres pour l'excitation afin de confirmer l'intégrité des protoplastes et la présence de la fluorescence GFP dans la population de protoplastes. Un minimum de débris est nécessaire pour éviter l'obstruction du bec de tri ; triez les PROTOPLASTES isolés dans le tampon TEX par trieur cellulaire.À l’aide d’un embout macro avec un orifice de 200 micromètres, à des taux d’événements compris entre 6 000 et 15 000 et à une pression système d’environ neuf PSI, suivre un protocole adapté en utilisant des protoplastes sauvages non GFP afin de déterminer les seuils d’autofluorescence pour trier les protoplastes positifs pour la GFP à l’aide d’un laser Argonne refroidi par air fonctionnant à 100 milliwatts sur une ligne argon de 488 nanomètres. Pour détecter la fluorescence GFP, utiliser un filtre passe-bande 530/30 après la collecte des protoplastes positifs pour la GFP. Examinez à nouveau les protoplastes triés au microscope, comme précédemment avant le début du tri, pour l’analyse d’expression.Extraire l'ARN total à partir des protoplastes triés. Le cDNA peut ensuite être préparé pour l'hybridation. Le cDNA est ensuite soumis à l'hybridation sur des puces génomiques entières TH one OPSYS Ametri.Voici quelques résultats représentatifs du tri de protoplastes à partir du témoin de type sauvage. Les protoplastes ne présentent aucun signal dans la fenêtre GFP positive. Toutefois, des signaux positifs pour la GFP sont détectés dans les échantillons de protoplastes isolés des lignées GAL 4G FP avant le tri, tandis que les protoplastes isolés de plantes de type sauvage ne montrent aucune fluorescence GFP lors des analyses en microscopie à balayage laser confocal (CLSM).Lorsqu'un mélange de protoplastes sans fluorescence et présentant une fluorescence GFP est détecté dans les échantillons de protoplastes provenant de lignées GAL 4G FP après faits. L'analyse en microscopie à balayage laser confocal indique l'isolement de protoplastes GFP positifs à partir d'une lignée GAL 4G FP représentative. L'ARN peut être extrait des protoplastes isolés, et un millilitre fournit une quantité suffisante d'ARN pour être détectée par fluorométrie. Nous venons de vous montrer comment isoler des protoplastes foliaires à partir d'atopy ANA pour le tri cellulaire assisté par fluorescence et l'analyse de l'expression génique spécifique à un type cellulaire.Lors de cette procédure, il est important de manipuler délicatement les protoplastes et d'en limiter l'exposition à la lumière. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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