Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana

Pour examiner les réponses des phytochromes dans des types cellulaires végétaux spécifiques. Le piège à activateur GAL4-GFP et les lignées transgéniques U-A-S-B-V-R sont croisés afin de produire des plantes déficientes en phytochrome. Des protoplastes foliaires issus de la descendance U-A-S-B-V-R croisée avec GA4-GFP sont isolés à partir de plantes.

Ensuite, les protoplastes sont triés selon des critères permettant d'isoler séparément les protoplastes négatifs pour la GFP et les protoplastes positifs pour la GFP ; les protoplastes isolés sont ensuite analysés par microscopie confocale à balayage laser. Afin de confirmer la collecte des protoplastes positifs pour la GFP, l'ARN est extrait des protoplastes et analysé de manière spectrale. Bonjour, je suis Sanka Pivar du laboratoire de BARDA Montgomery au Département de recherche végétale sur l'énergie du Laboratoire national de recherche végétale de l'Université d'État du Michigan.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement de protoplastes foliaires à partir d'une plante ANA pour le tri cellulaire assisté par fluorescence et l'analyse de l'expression génique spécifique à un type cellulaire. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les réponses dépendantes des phytochromes spécifiques aux tissus et aux organes. Commençons donc.

La lignée ANA d'Arabidopsis utilisée dans cette procédure a été obtenue par une approche bipartite de piégeage d'enhanceur. L'un provient d'une bibliothèque de lignées de piégeage d'enhanceur présentant différents patrons d'expression de gal ou d'expression. Le parent un exprime également la GFP sous le contrôle d'une séquence d'activation en amont ou UAS.

En résumé, le facteur de transcription GA four active tout gène placé sous le contrôle de l'UAS. Dans la lignée parentale un, GA four active GFP ; le parent un a été croisé avec le parent deux. Chez le parent deux, le gène BVR est sous le contrôle de GAL four via l'UAS.

La lignée issue du croisement est U-A-S-B-V-R croisée avec G 4G FP. Chez les lignées parentales, la biosynthèse du chromophore phytochrome quatre s'effectue à partir d'un LA, puis de l'hème, jusqu'au biver, abrégé en bv. Mais chez la descendance, le produit du gène BVR bloque la biogenèse du chromophore phytochrome en réduisant le précurseur BV. Cette lignée de descendance BVR, confirmée comme piège à enhanceurs, peut être utilisée pour examiner comment une réduction des niveaux de phytochrome actif affecte différents tissus végétaux.

Commencez cette procédure en préparant le sol et les pots pour la culture de plantes afin de générer des protoplastes foliaires. Stérilisez environ 2000 graines par échantillon et par expérience sur du sol dans des pots. Ajoutez de l'eau au fond du plateau contenant les pots et recouvrez entièrement le plateau d'une pellicule plastique.

Faire pousser les plantes pendant cinq semaines sous éclairage blanc à 22 degrés Celsius et 70 % d'humidité. Après les cinq à six premiers jours, la germination des graines est confirmée et l'emballage plastique est retiré du plateau. Afin d'isoler les protoplastes, préparer d'abord le tampon TEX : pour un litre de tampon, peser les sels GA's B, le MES, le chlorure de calcium, le nitrate d'ammonium et le saccharose.

Dissoudre complètement les composants dans environ 900 millilitres d'eau distillée désionisée, abrégée DD H2O, et ajuster le pH à 5,7 à l'aide de KOH 1 M. Porter ensuite le volume final à un litre et stériliser par filtration.

Ensuite, prélevez des feuilles saines et vertes sur les plantes. Rassemblez environ 250 millilitres de feuilles légèrement tassées dans un bécher. Rincez les feuilles avec 40 millilitres d'eau.

DD H2O quatre fois, puis rincer deux fois avec du DD H2O stérile à l’aide d’un scalpel numéro 20. Couper les feuilles en fines lamelles et répartir équitablement le tissu dans deux tubes en plastique stériles de 50. Un volume x de mélange de digestion des feuilles est préparé en ajoutant un aliquot de cinq millilitres de solution mère 10 x, préparée en dissolvant 2 % poids par volume de mazy R 10 et 4 % poids par volume de cellulase on azua R 10 dans du tampon TEX, à 45 millilitres de tampon TEX frais.

Ajoutez environ 25 millilitres d'une digestion de feuille à 1 x. Mélangez avec les bandes de feuilles dans chaque tube afin que tous les tissus foliaires soient recouverts. Procédez ensuite à la mise sous vide, puis à l'infiltration du tissu foliaire dans la solution de digestion.

Mélanger dans des tubes ouverts pendant une heure à température ambiante à l’aide d’un dessiccateur sous vide relié à une pompe à eau. Garder les tubes contenant le tissu foliaire et le mélange de digestion foliaire enveloppés dans du papier d’aluminium afin d’éviter toute exposition à la lumière. Poursuivre par une incubation de trois heures à température ambiante sur un agitateur rotatif avec agitation douce.

Après trois heures, augmentez la vitesse d'oscillation pendant deux minutes afin de libérer les protoplastes. Filtrez la suspension brute de protoplastes à travers deux couches de gaze stérile pour éliminer les débris et recueillir le filtrat dans un bécher en verre stérile. Filtrez ensuite le filtrat à travers un tamis en nylon stérile de 100 micromètres dans une boîte de Pétri stérile.

Recueillir l'écoulement et le transférer dans un nouveau tube stérile de 50 millilitres. Utiliser environ 15 à millilitres de tampon TEX frais pour laver la boîte de Pétri stérile et récupérer les protoplastes éventuellement présents à la surface. Centrifuger l'écoulement à 100 fois la gravité à 10 degrés Celsius pendant 15 minutes à l'aide d'une centrifugeuse à godets oscillants, avec une accélération réglée à six et une décélération à zéro lorsque la centrifugation est terminée.

Utilisez une pipette en verre stérile de neuf pouces reliée à une pompe péristaltique pour éliminer environ 25 à 30 millilitres du liquide situé sous la couche de protoplastes flottants, qui contient les débris résiduels et pelletés, sans perturber la couche de protoplastes flottants, en laissant environ 10 à 50 millilitres. Après avoir éliminé les débris pelletés, ajoutez du tampon TEX frais jusqu'à un volume final de 40 millilitres. Tout en resuspendant délicatement les protoplastes, répétez l'élimination des débris et la resuspension des protoplastes flottants restants.

Deux fois supplémentaires afin d'éliminer le plus possible les débris cellulaires D. La durée de centrifugation est réduite à 10 minutes lors de la première répétition et à cinq minutes lors de la dernière répétition. Enfin, utilisez une pipette de transfert stérile de un millilitre pour aspirer les protoplastes en suspension et les transférer dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Passez directement au tri avant le tri. Examinez les protoplastes par microscopie à balayage laser confocal ou CLSM, en bref, en utilisant un laser de 488 nanomètres pour l'excitation afin de confirmer l'intégrité des protoplastes et la présence de la fluorescence GFP dans la population de protoplastes. Un minimum de débris est nécessaire pour éviter l'obstruction du bec de tri ; triez les PROTOPLASTES isolés dans le tampon TEX par trieur cellulaire.

À l’aide d’un embout macro avec un orifice de 200 micromètres, à des taux d’événements compris entre 6 000 et 15 000 et à une pression système d’environ neuf PSI, suivre un protocole adapté en utilisant des protoplastes sauvages non GFP afin de déterminer les seuils d’autofluorescence pour trier les protoplastes positifs pour la GFP à l’aide d’un laser Argonne refroidi par air fonctionnant à 100 milliwatts sur une ligne argon de 488 nanomètres. Pour détecter la fluorescence GFP, utiliser un filtre passe-bande 530/30 après la collecte des protoplastes positifs pour la GFP. Examinez à nouveau les protoplastes triés au microscope, comme précédemment avant le début du tri, pour l’analyse d’expression.

Extraire l'ARN total à partir des protoplastes triés. Le cDNA peut ensuite être préparé pour l'hybridation. Le cDNA est ensuite soumis à l'hybridation sur des puces génomiques entières TH one OPSYS Ametri.

Voici quelques résultats représentatifs du tri de protoplastes à partir du témoin de type sauvage. Les protoplastes ne présentent aucun signal dans la fenêtre GFP positive. Toutefois, des signaux positifs pour la GFP sont détectés dans les échantillons de protoplastes isolés des lignées GAL 4G FP avant le tri, tandis que les protoplastes isolés de plantes de type sauvage ne montrent aucune fluorescence GFP lors des analyses en microscopie à balayage laser confocal (CLSM).

Lorsqu'un mélange de protoplastes sans fluorescence et présentant une fluorescence GFP est détecté dans les échantillons de protoplastes provenant de lignées GAL 4G FP après faits. L'analyse en microscopie à balayage laser confocal indique l'isolement de protoplastes GFP positifs à partir d'une lignée GAL 4G FP représentative. L'ARN peut être extrait des protoplastes isolés, et un millilitre fournit une quantité suffisante d'ARN pour être détectée par fluorométrie. Nous venons de vous montrer comment isoler des protoplastes foliaires à partir d'atopy ANA pour le tri cellulaire assisté par fluorescence et l'analyse de l'expression génique spécifique à un type cellulaire.

Lors de cette procédure, il est important de manipuler délicatement les protoplastes et d'en limiter l'exposition à la lumière. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.