Chronique Salmonella Modèle de souris infectées

L'objectif général de cette procédure est de mettre en place un modèle murin chroniquement infecté par Salmonella. Cela est réalisé en préparant tout d'abord une solution de Salmonella. La deuxième étape de la procédure consiste à administrer par gavage aux souris de la streptomycine, suivie de Salmonella, ou uniquement de la streptomycine.

La troisième étape de la procédure consiste à isoler la salmonelle à partir des matières fécales de souris et à détecter l'infection par la salmonelle dans l'intestin de la souris à l'aide de plaques chromogéniques BL. La dernière étape de la procédure consiste à observer et enregistrer la masse corporelle des souris et à noter les changements de vitalité après l'infection par la salmonelle. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent qu'une infection par la salmonelle peut être établie dans l'intestin de souris ayant reçu une gavage de salmonelle.

Bonjour, je suis Michelle P du laboratoire du Dr Johnson du Département de médecine de l'Université de Rochester. Je fais également partie du Laboratoire Sun et je suis Y du Laboratoire Sun. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'établir un modèle de masse infectée par Alytic Lennar.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la transduction des signaux lors de l'interaction hôte-bactérie et la genèse tumorale. Commençons donc. Avant l'expérimentation, préparez suffisamment de boîtes de gélose luria, berti ou LB pour chaque souche de salmonelle et pour l'ensemble de l'expérience.

Les plaques peuvent être réfrigérées et conservées pendant plusieurs mois. Ensuite, préparez une culture de salmonelle. Retirez un flacon de stock de salmonelle congelé à moins 80 degrés Celsius et laissez-le décongeler sur le plan de travail pour ensemencer la flamme de salmonelle.

Stérilisez une anse bactériologique dans la flamme d'un bec Bunsen, puis plongez-la dans la souche bactérienne décongelée. Tracez des lignes en zigzag avec l'anse sur le tiers supérieur de la boîte de gélose LB. Repassez l'anse à la flamme, puis tournez la boîte.

Effectuez un mouvement en zigzag avec la boucle pour croiser les stries précédentes et répartir les bactéries sur le deuxième tiers de la boîte. Répétez une fois de plus. Repassez la boucle à la flamme.

Ne laissez pas le porte-anneau pénétrer dans l'agar. Laissez les colonies se développer en conservant les boîtes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Si l'opération est correctement réalisée, la boîte contenant la salmonelle devrait présenter des colonies individuelles dans au moins une section.

Le lendemain, prélever un clone à partir de la boîte de Pétri LB à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’un anneau de prélèvement bactérien, puis l’insérer dans 7 mL de bouillon LB contenu dans un tube de 12 mL. Agiter le tube à 37 degrés Celsius pendant environ cinq heures.

Utilisez 0,05 millilitres de cette culture pour l'inoculation. Ajoutez 50 millilitres de LB dans un tube Falcon. Incubez à 37 degrés Celsius sans agitation pendant environ 18 heures.

Faire centrifuger la culture bactérienne de 50 millilitres incubée toute la nuit à température ambiante à 5 000 tr/min pendant 10 minutes et jeter le surnageant. Ensuite, ajouter 1,5 millilitre de solution saline tamponnée au Hank ou HBSS dans le tube pour resuspendre les bactéries, soit un rapport de 100 parties de LB pour 3 parties de HBSS. Puis porter le volume total à 15 millilitres avec du HBSS, ou un rapport de 1 à 10 de LB par rapport au HBSS.

Chaque souris nécessite 100 microlitres de culture diluée de salmonelle, soit entre 1 × 10⁶ et 1 × 10⁸ unités formant colonies, avant de commencer le jeûne en eau et en nourriture quatre heures avant l'expérimentation. Préparez ensuite une solution de streptomycine juste avant la gavage en diluant 7,5 milligrammes de streptomycine en poudre dans 100 microlitres de HBSS. Pour chaque souris injectée, prévoyez un volume supplémentaire afin de compenser les pertes avant la gavage chez la souris.

Préparez d'abord une canule d'alimentation contenant 100 microlitres de solution de streptomycine. Retirez la première souris de la cage afin de lui administrer une gavage et maintenez la souris tournée vers le plan de travail. Saisissez fermement la peau située au-dessus de l'épaule de la souris entre le pouce et le majeur, puis étirez la tête et le cou à l'aide de l'index afin de redresser l'œsophage.

Diriger l'extrémité arrondie de l'aiguille d'alimentation le long du palais et vers le côté droit de la partie postérieure du pharynx. Ensuite, l'introduire doucement dans l'œsophage et injecter les 100 microlitres de solution de streptomycine. Aucune résistance ne doit être ressentie.

Répétez ce processus pour toutes les souris expérimentales et témoins soumises à l'expérimentation. Environ 20 heures après le strp de m et la gavage, et quatre heures avant la gavage de salmonella, retirez l'eau et la nourriture des souris qui recevront la gavage de salmonella par voie orale. Effectuez la gavage de chaque souris de la même manière qu'auparavant, en utilisant 100 microlitres de solution de salmonella dans du HBSS.

Après la gavage, transférer chaque souris dans une nouvelle cage pour commencer la collecte des selles. Environ huit heures après le gavage, retirer les matières fécales de la cage immédiatement après leur expulsion. Prélever 100 milligrammes de matière fécale de souris comme échantillon expérimental.

Prélèvez des échantillons quotidiennement ou hebdomadairement, selon la durée de l'étude, pour l'analyse de Salmonella dans les matières fécales. Transférez l'échantillon fécal dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un millilitre de PBS et vortexez vigoureusement, puis centrifugez pendant 10 minutes à 800 tr/min. Transférez le surnageant dans un tube de 1,5 millilitre propre et centrifugez à 6 000 tr/min pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et ajoutez 200 microlitres de PBS aux culots ; vortexez pour resuspendre. Ensuite, détectez la salmonelle à l’aide d’une plaque BB l roag. Utilisez de 10 à 100 microlitres de solution de matière fécale par plaque, en étalant sur la plaque comme indiqué dans la section deux.

Les espèces de salmonelles apparaissent en couleur rose en raison de différences métaboliques en présence de chromogènes sélectionnés. Comptez les colonies de salmonelles sur la boîte de Petri afin de comparer le niveau d'infection entre des souris individuelles. Dans cette procédure expérimentale, nous avons utilisé des souris femelles C57BL/6 sans agents pathogènes spécifiques âgées de six à sept semaines.

Les souris ont été infectées par Salmonella et de la streptomycine associée à HBSS. Les souris ont reçu par gavage contrôlé uniquement de la streptomycine. Les souches de Salmonella utilisées comprennent la souche sauvage de Salmonella typhimurium, ATCC 1 4 0 2 8 S FPC, une souche mutante non pathogène de Salmonella, ainsi que trois souches FPC du laboratoire du Dr James Madera portant le gène de virulence associé AAV R age sur le plasmide de faible copie PSKW 29. À l’aide de ce protocole, la colonisation par Salmonella typhimurium peut être détectée dans l’intestin de la souris.

L'infection chronique par Salmonella a été mesurée par analyse des matières fécales et des échantillons de tissu intestinal, et des prélèvements de poids corporel ont été recueillis pour une coloration immunofluorescente. Généralement, une perte de poids corporel et la mort surviennent dans les quatre semaines suivant l'infection. Les proportions de survie quatre semaines après l'infection sont indiquées ici.

Une fois que les souris survivent quatre semaines après l'infection, elles reprennent du poids corporel et la fréquence des décès diminue au cours des 23 semaines restantes. Dans l'ensemble, plus de 65 % des souris infectées par des souches de Salmonella, FSY fsy, A VRA nulle ou fsy. A VRA hétérozygote peuvent survivre plus de six mois avec une infection persistante de Salmonella dans l'intestin.

Après l'infection aiguë, les survivants continuaient à porter des salmonelles, qui pouvaient être détectées six mois après l'infection à l'aide de la méthode décrite dans ce protocole. L'analyse en immunofluorescence d'échantillons tissulaires provenant de l'intestin de souris montre l'invasion des salmonelles dans la muqueuse intestinale à 27 semaines post-infection. Sur cette image, les noyaux sont colorés en bleu et les cellules infectées par les salmonelles apparaissent en vert.

Comme le montre le groupe témoin, il n'y a pas de coloration verte vif, ce qui indique une absence de colonisation par la salmonelle. En revanche, chez les souris infectées par la salmonelle à 27 semaines post-infection, on observe une coloration verte vif dans la muqueuse intestinale. Cela démontre la persistance de l'infection à salmonelle chez la souris prétraitée à la streptomycine.

Nous venons de vous montrer comment induire une infection chronique chez la souris. Lorsque vous réalisez cette procédure, il est important de vous souvenir de préparer une culture fraîche pour le garage, de maîtriser correctement les techniques de garage et de détecter la présence d'anticorps antinucléaires (ANA) afin de vous assurer que votre modèle expérimental fonctionne. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.