Name: Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules doignon Utilisation du pistolet à gènes Helios (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Apprenez la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) pour étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules d'oignon en utilisant le pistolet à gènes Helios. Cette méthode permet de visualiser les interactions entre facteurs de transcription in vivo.

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Nous remercions les Drs. Steve Mount et Zhang Xiaoning pour le 35S:: GFP pGlowbug construire et l&#39;Hokensen Bourse de doctorat au CH de recherche dans le laboratoire de Z. L&#39;s est soutenue par le US National Science Foundation (IOB0616096 et MCB0744752). ZL est partiellement pris en charge par l&#39;Université du Maryland de la station expérimentale agricole.

I. préparation de plasmide L'ADN plasmidique utilisé pour le bombardement doit être de haute pureté et à une concentration de 500ng/μl ou supérieure. Pour BiFC impliquant deux constructions plasmidiques, 25 pg de chaque plasmide est nécessaire. En d'autres termes, rapport molaire 1:1 des deux plasmides doivent être mélangés pour donner naissance à 50 pg d'ADN plasmidique total pour la préparation des cartouches. Soyez conscient que l'ajout de plus d'ADN de 50 mg peut provoquer une agglomération des particules d'or et devrait être évitée. Disponibles dans le commerce des kits d'extraction d'ADN plasmidique sont recommandés pour les isoler des ADN plasmidiques. Les vecteurs plasmidiques devraient être relativement de petite taille tels que pUC19. Nous avons cloné SEU et LUH ADNc dans pUC19-SPYNE et pUC19-SPYCE, respectivement 3. Vecteurs binaires pour transformation par Agrobacterium sont trop grosses et inadaptées pour le bombardement. II. Cartouche préparation Préparation des cartouches implique des particules d'or revêtement avec l'ADN plasmidique et leur chargement dans le tuyau en plastique qui est ensuite découpé en morceaux moitié pouce de long, qui peut être chargé dans la cartouche porteurs du gène pistolet. Préparation des cartouches est décrit en détail une grande dans un article séparé Jove 4 et n'est donc pas décrite ici. Pour le bombardement de cellules d'oignon, nous vous recommandons de mélanger 50 ug d'ADN plasmidique avec 12,5 mg de particules d'or par la préparation, ce qui donne environ jusqu'à 50 cartouches à 1 ug DNA/0.25 mg d'or / cartouche. Chaque cartouche est d'un seul coup. Les particules d'or peut être soit 0,6 um ou 1,0 m de diamètre (Cat # 1652262 # 1652263 ou Cat; Biorad). Nous recommandons aussi d'utiliser 0,5 mg / ml solution PVP pour la préparation des cartouches. Pour BiFC, combiner les deux ADN plasmidique de chaque partenaire d'interaction putative dans la préparation même cartouche. Après une préparation cartouche, il est important de tester les cartouches en tirant des cartouches nouvellement faite à une pression d'hélium entre 150 à 200 psi dans un Parafilm carré qui est enroulé autour d'une boîte de Pétri. Ce sera de tester si les particules d'or peut être propulsé de manière efficace à partir des cartouches, vous devriez voir les particules d'or pâle sur le Parafilm. Cela vous donne une idée de la zone qui couvrira chaque tir. Vous remarquerez peut-être différentes quantités de particules d'or propulsé sur la Parafilm à différentes pressions d'hélium (à 150-200 gamme de psi). S'il n'y a pas de différence significative, choisissez la basse pression pour le bombardement. III. Préparation des tissus d'oignon Le jour du tournage, décollez la peau extérieure d'un gros oignon jaune. En utilisant une lame de rasoir propre et bien aiguisé, couper 4-5 couches profondes d'une zone rectangulaire d'environ 2 x 8 cm. Sortez le tissu rectangulaires oignons, jetez les deux couches extérieures, couper les autres couches de l'oignon en morceaux environ 2x1.5 cm. Placez les morceaux d'oignon dans une boîte de Petri contenant du papier filtre (papier Whatman 3MM couper en cercles) humidifié avec de l'eau stérile. Couvrir le plat de Pétri et ils sont prêts à aller. IV. Bombardement <ol><li> Charger les cartouches dans le porte cartouche ronde blanche. Cartouches contenant différentes constructions plasmidiques doivent être chargés en porte-cartouches différentes. Chaque support de la cartouche peut contenir jusqu'à 12 cartouches pour 12 tirs. </li><li> Insérez la batterie et la doublure baril frais dans le pistolet à gènes Helios. Assurez-vous que le liner baril et le pistolet ont respectifs joints toriques joints. </li><li> D'abord, insérez un support cartouche vide dans le canon à gènes, avec la marque N ° 12 sur le support de la cartouche vers le sommet de l'arme. Support de la cartouche d'avance une ou deux fois pour s'assurer qu'elle est insérée correctement. </li><li> Fixez pistolet au réservoir d'hélium et d'ajuster la pression entre 150 à 200 psi. </li><li> Porter une protection auditive et le pistolet feu à quelques reprises avec le support de la cartouche vide pour nettoyer la chambre de l'arme et de s'assurer que la pression est stable. </li><li> Retirez le support de la cartouche vide et insérer un support de la cartouche chargée. Faire progresser le support de la cartouche de sorte que la cartouche que vous voulez le feu est placé au fond (06 heures) du support de la cartouche. Tir d'un morceau d'oignon ici fournit une forme de contrôle négatif pour la fluorescence de fond. </li><li> Placez les morceaux d'oignon au milieu d'un plat vide Petri avec la couche la plus interne de l'oignon vers le haut. Reste paquebot le baril du pistolet gène sur boîte de Pétri et le feu au pistolet en appuyant sur le bouton latéral tout en tirant sur la gâchette. Transférer les oignons bombardé à une boîte de Petri contenant humides papier 3MM filtre. </li><li> Avance à la cartouche suivante et le feu un morceau d'oignon différent. Répétez cette étape jusqu'à ce que quatre à cinq morceaux d'oignons sont fusillés. Chaque morceau d'oignon est tiré une fois. </li><li> Changer pour un support de cartouche différents chargé avec des cartouches contenant une combinaison de différents plasmides ou différents plasmides. N'oubliez pas de changer le liner le baril unes bien pour empêcher la contamination. Tirez sur quatre à cinq morceaux d'oignon. </li><li> Après le bombardement, retourner toutes les oignons aux plats perti. Couvrir les boîtes de Pétri avec des couvercles. Enveloppez-les avec du Parafilm pour éviter le dessèchement. Incuber les morceaux d'oignon à la température ambiante dans l'obscurité pendant 16 à 48 heures. </li><li> Éteignez la pression du gaz et de libération avant de détacher le pistolet à gènes à partir du réservoir d'hélium. Dévissez la doublure baril, et retirez le support de la cartouche et les cartouches utilisées (ou non). </li><li> Nettoyage porte-cartouches et les doublures baril en les submergeant dans un bécher avec de l'eau savonneuse. Placer le bécher dans un bain d'ultrasons et soniquer pendant 20 minutes. Ensuite, les rincer à l'eau pour enlever tous les résidus de savon. Faites-les tremper dans de l'éthanol à 70% pour une heure, puis les sécher sur du papier absorbant. </li></ol> V. Observation <ol><li> Après une incubation morceaux d'oignon bombardé pendant 16-20 heures à température ambiante, on peut observer la GFP ou YFP fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence comme le Zeiss Axio Observer.z1 utilisées dans cette étude. </li><li> Utilisez une pince à bouts plats lentement peler une couche de cellule unique hors de l'épiderme interne de l'oignon (la couche qui donne directement sur le pistolet pendant le bombardement). Placez le zeste sur une goutte d'eau sur une diapositive. Ajouter lamelle mais attention à minimiser les bulles. </li><li> Sous champ lumineux du microscope, vérifiez d'abord pour le streaming cytoplasmique de s'assurer que les cellules sont vivantes. Pour ce faire, exposer la diapositive à la lumière brillante de terrain pendant quelques minutes pour réchauffer le tissu oignon et ensuite chercher plastes mouvement. Le streaming cytoplasmique n'est pas toujours facile à voir, donc ne vous découragez pas si vous ne pouvez pas voir toute. </li><li> Pour la détection de fluorescence, l'utilisation d'excitation appropriée et des filtres de détection de la GFP ou YFP. Il est important d'inclure des contrôles négatifs, comme les morceaux d'oignon tourné avec un plasmide non fluorescent. Faint signaux jaune peut apparaître à partir des cellules blessés, des bulles d'air, ou de débris. Il est également important d'inclure des contrôles positifs. Un plasmide contenant journaliste exprimée de façon constitutive fluorescents tels que 35S:: GFP est un excellent contrôle positif. Signaux GFP visibles à partir des cellules épidermiques d'oignon (figure 1A, D) a indiqué que les cartouches, les tissus d'oignon, et le tir au canon de gènes sont bien préparés et exécutés. Par la suite, nous avons observé les interactions entre SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE en morceaux l'oignon bombardés avec des cartouches contenant un mélange de 35S:: SEU-pSPYNE et 35S:: LUH-pSPYCE ADN. Faint fluorescence YFP a été observée dans le noyau uniquement (figure 1 B, E), indiquant l'interaction physique directe entre SEU et LUH qui a amené les fragments YFP diviser ensemble dans le noyau. Notez que le signal de la YFP BiFC est significativement plus faible que le signal GFP du 35S:: GFP. </li></ol> Les résultats représentatifs Dans notre étude rapportée ici, le 35S:: contrôle positif GFP plasmide dégage une forte fluorescence qui remplit toute la cellule, y compris à la fois le noyau et le cytoplasme (figure 1A, D). Protéine GFP est assez petit pour se diffuser dans le noyau sans un signal de localisation nucléaire. En revanche, SEU et LUH sont deux facteurs de transcription chez Arabidopsis déjà montré à interagir dans un double-hybride en levure de test 2. Seu-pSPYNE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP) et LUH-pSPYCE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP), à la fois trop grand pour diffuser dans le noyau, contenant des signaux de localisation nucléaire de 2,5. Le signal de fluorescence détecté YFP dans le noyau de la cellule d'oignon (figure 1 B, E) indique que SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE peuvent interagir dans les noyaux d'oignon. Aucun signal fluorescent est détecté dans les oignons bombardés avec un mélange plasmide de pSPYNE vecteur plasmidique contenant le fragment N-terminal de la YFP et Luh-pSPYCE (figure 1C, F). La fluorescence BiFC médiée YFP est significativement plus faible que la fluorescence de la GFP-médiatisée de la 35S:: GFP plasmide. Dans notre étude, ils ont également montré différentes localisation subcellulaire (comparer avec la figure 1A B). De plus, le nombre de cellules fluorescentes est significativement plus faible pour BiFC, comme BiFC ne fonctionne que lorsque les deux plasmides partenaires réussir à entrer et sont exprimés dans les cellules d'oignon mêmes. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Fluorescent (A, B, C) ​​et le champ lumineux (D, E, F) des images de cellules d'oignon bombardés avec différentes constructions plasmidiques. (A) et (D), des cellules d'oignon bombardés par 35S:: GFP. GFP se diffuse à travers le cytoplasme et le noyau. (B) et (E), des cellules d'oignon bombardés par l'égalité de mélange molaire de 35S:: SEU-pSPYNE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP) et 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fusionné au fragment C-terminal ) d'ADN plasmidique. Une interaction entre SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE est représenté par un noyau fluorescent. (C) et (F), un contrôle négatif montrant des cellules d'oignon bombardés avec des mélanges de vecteur pUC19-SPYNE et LUH-pSPYCE plasmiDS. Aucun signal fluorescent est détecté.

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li>
<li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li>
<li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li>
<li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li>
</ol>

<ol><li> Pour les utilisateurs de première fois, nous vous recommandons de pratiquer toute la procédure, de la préparation Cartouche d&#39;observation, avec un seul reporter constitutive plasmide tel que 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Nous avons utilisé un 35S:: plasmide GFP obtenu de MM. Steve Mount et Zhang Xiaoning 6 (figure 1A, D). Les cartouches gène tiré de contrôle vendus à RioRad (Cat 165-2244) ne sont pas appropriées pour les plantes. </li><li> Pour BiFC, un deuxième contrôle positif est nécessaire, ce qui devrait se composent de d...

<table><tbody><tr><td>Oignon jaune</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon à gènes Helios</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence avec filtres appropriés pour GFP ou YFP</td><td>Zeiss, Nikon, Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bimoléculaire complémentation de fluorescence (bifc) dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon utilisation du pistolet à gènes helios

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Enquête sur la fonction des gènes dans des organismes variés s&#39;appuie sur la connaissance de la façon dont les produits des gènes interagissent les uns avec les autres dans leur environnement cellulaire normal. La complémentation bimoléculaire fluorescence (BiFC) Assay<sup&gt; 1</sup&gt; Permet aux chercheurs de visualiser les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et est devenu un outil de recherche indispensable. Ce dosage est basé sur l&#39;association facilitée de deux fragments d&#39;une protéine fluorescente (GFP) qui sont chacun fusionné à une protéine interagissant partenaires potentiels. L&#39;interaction des deux protéines partenaires serait de faciliter l&#39;association de la N-terminal et fragment C-terminal de la GFP, conduisant à la fluorescence. Pour les chercheurs cellules végétales, oignons épidermiques sont un système idéal d&#39;expérimentation pour la réalisation du dosage BiFC raison de la facilité à obtenir et à préparer les tissus oignon et la visualisation directe de la fluorescence avec la fluorescence de fond minimal. Le pistolet à gènes Helios (BioRad) est couramment utilisé pour bombarder l&#39;ADN plasmidique dans les cellules d&#39;oignon. Nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;Hélios pistolet à gènes à introduire constructions plasmidiques pour deux interagissant<em&gt; Arabidopsis thaliana</emFacteurs de transcription&gt;, Seuss (UFE) et HOMOLOGUE LEUNIG (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt; Et la visualisation de leurs interactions médiées par les cellules d&#39;oignon BiFC épidermique.

Cet article illustre comment utiliser correctement l&#39;Helios BioRad Gene Gun pour introduire l&#39;ADN plasmidique dans les cellules de l&#39;épiderme et l&#39;oignon comment tester interactions protéine-protéine dans les cellules de l&#39;oignon basé sur le principe de complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC)

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

L'étude de la fonction des gènes chez divers organismes repose sur la connaissance de la manière dont les produits géniques interagissent entre eux dans leur environnement cellulaire normal...

Cette procédure teste l'interaction in vivo entre deux régulateurs transcriptionnels d'Arabidopsis, SEUSS (abréviation de SEUSS, ou SEU) et LU HOMOLOG (ou LUH). En utilisant la complémentation de fluorescence biomoléculaire, SEUSS est fusionné au fragment terminal N de la protéine fluorescente jaune (YFP), tandis que LUH est fusionné au fragment terminal C de YFP-DNA provenant des deux constructions plasmidiques. Les protéines SEUSS-NYFP et LUH-CYFP sont ensuite transférées par bombardement dans des cellules épidermiques d'oignon afin de tester leur interaction.Une interaction entre Seuss et LUH provoque l'association des fragments terminal N et terminal C de YFP dans les noyaux, entraînant une fluorescence de YFP dans les noyaux. Après une incubation de 16 à 20 heures à l'obscurité, les écales épidermiques d'oignon sont observées au microscope à fluorescence afin de visualiser la fluorescence. Bonjour, je suis Courtney Hollander du laboratoire du Dr Zhi Lu du Département de biologie cellulaire et génétique moléculaire de l'Université du Maryland.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de tester l'interaction entre protéines dans des cellules d'oignon à l'aide du canon à gènes BioRad Helios. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour analyser les interactions entre protéines ainsi que la localisation des protéines dans les cellules végétales. Commençons donc.Pour commencer cette procédure, préparez les cartouches pour le canon à gènes Helios en suivant le protocole Joe Video de Woods et Zeto 2008, qui décrit en détail la procédure de préparation des cartouches pour chaque préparation. Cinquante microgrammes d'ADN plasmidique total sont mélangés avec 12,5 milligrammes de particules d'or et une solution de PVP à 0,5 milligramme par millilitre pour la BIFC. En combinant la même préparation de cartouche, les deux ADN plasmidiques des protéines en interaction présumée Seuss fusionnée à la moitié N-terminale de YFP, abrégée seus, NYFP, et l'homologue de LU fusionné à la moitié C-terminale de YFP, abrégé L-U-H-C-Y-F-P, sont utilisés.La quantité totale est de 50 microgrammes par préparation, permettant d'obtenir jusqu'à 50 cartouches avec un microgramme d'ADN par 0,25 milligramme d'or par cartouche. Chaque cartouche est destinée à un tir unique. Après la préparation des cartouches, testez-les afin de déterminer si les particules d'or sont efficacement propulsées.Enveloppez un carré de paraforme autour d'une boîte de Pétri. Réglez ensuite la pression d'hélium entre 150 et 200 psi et tirez les cartouches nouvellement fabriquées dans le carré de paraforme. Observez de fines particules dorées sur le paraforme.Différentes quantités de particules d'or peuvent être propulsées sur le parfum à différentes pressions d'hélium. Toutefois, en l'absence de différence significative, choisissez la pression la plus faible pour le bombardement. Ce test indique également la zone couverte par chaque tir.Pour préparer les tissus d'oignon, retirez la peau externe d'un oignon jaune de grande taille à l'aide d'une lame de rasoir propre et aiguisée. Découpez une zone rectangulaire de deux sur huit centimètres, d'une profondeur de quatre à cinq couches. Retirez le tissu d'oignon rectangulaire et jetez les deux couches externes.Coupez les couches restantes de l'oignon en morceaux carrés d'environ 1,5 centimètre de côté. Placez les morceaux d'oignon dans une boîte de Pétri contenant des disques de papier filtre de trois mm. Humidifiez avec de l'eau stérile et couvrez la boîte de Pétri.Les morceaux d'oignon sont prêts pour le bombardement. Chargez d'abord les cartouches dans les porte-cartouches ronds blancs ; insérez des cartouches contenant des constructions plasmidiques différentes dans des porte-cartouches distincts. Chaque porte-cartouche peut contenir jusqu'à 12 cartouches, soit 12 tirs.Trois supports différents sont chargés ici. Le premier support contient des cartouches avec un promoteur fort et constitutif 35 S-G-F-P-A provenant du virus de la mosaïque du chou-fleur. Ce plasmide sert de témoin positif.Le deuxième support est chargé avec les cartouches expérimentales contenant une quantité égale de S-E-U-N-Y-F-P et de L-U-H-C-Y-F-P. Le troisième support de cartouche est chargé avec des cartouches contenant un mélange équimolaire du vecteur spine de puck et de l'assaisonnement LUH puck. Ceci sert également de contrôle négatif.Insérez la batterie et le nouveau manchon de canon dans le canon à gènes Helios. Assurez-vous que le manchon de canon et le canon sont chacun équipés de leur joint torique respectif. Ensuite, insérez un porte-cartouche vide dans le canon à gènes, en orientant la marque numéro 12 sur le porte-cartouche vers le haut du canon.Avancez le support de cartouche une ou deux fois pour vous assurer qu’il est correctement inséré. Ensuite, fixez le pistolet sur la bouteille d’hélium et réglez la pression entre 150 et 200 PS. Portez une protection auditive et tirez quelques fois avec le pistolet en maintenant le bouton latéral enfoncé tout en actionnant la gâchette. Tirer avec le support de cartouche vide permet de nettoyer la chambre du pistolet et garantit une pression stable.Avant de tirer l'ADN, tirer un morceau d'oignon ici peut servir de contrôle négatif pour la fluorescence de fond. Pour tirer les particules d'or revêtues d'ADN, retirez le support de cartouche vide et insérez le premier support de cartouche chargé contenant le contrôle positif. Avancez le support de cartouche afin que la cartouche destinée à être tirée soit positionnée en bas du support de cartouche.Placez maintenant des morceaux d'oignon au centre d'une boîte de Pétri vide, la couche la plus interne de l'oignon orientée vers le haut. Appuyez le tube interne du pistolet à gènes contre la boîte de Pétri et déclenchez le tir. Passez à la cartouche suivante et tirez sur un morceau d'oignon différent.Répétez cette étape jusqu'à ce que quatre à cinq morceaux d'oignon soient tirés. Chaque morceau d'oignon n'est tiré qu'une seule fois après le tir. Transférez le morceau d'oignon bombardé dans une boîte de Pétri contenant du papier filtre humide de trois mm pour tirer les cartouches expérimentales.Passer au cartouche Holden. Numéro deux, pensez à remplacer le manchon du canon afin d'éviter toute contamination. Tirer quatre à cinq morceaux d'oignon comme vient d'être montré pour le témoin positif.Ensuite, passez au cartouche Holden numéro trois, contenant l'ADN témoin négatif. Et de nouveau, projetez quatre à cinq morceaux d'oignon.Changer la douille du barillet pour éviter toute contamination. Après le bombardement, couvrir les boîtes de Petri contenant les morceaux d'oignon avec leurs couvercles.Enveloppez-les avec du paraforme pour éviter le dessèchement. Incubez les morceaux d'oignon à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 16 à 48 heures. Une fois le bombardement terminé, éteignez le gaz et relâchez la pression avant de déconnecter le canon à gènes du réservoir d'hélium, dévissez le manchon du canon et retirez le support de cartouche et les cartouches usagées.Enfin, nettoyez les supports de cartouche et les douilles internes en les plongeant dans un bécher contenant de l’eau savonneuse et en les soumettant à une sonication pendant 20 minutes. Rincez ensuite à l’eau pour éliminer tous les résidus de savon.Imbiber dans de l'éthanol à 70 % pendant une heure, puis sécher sur des serviettes en papier. Procéder à l'observation des morceaux d'oignon 16 à 20 heures après le bombardement. Après avoir incubé les morceaux d'oignon bombardés pendant 16 à 20 heures à température ambiante, utiliser une pince à extrémités plates pour détacher lentement une seule couche cellulaire de l'épiderme interne de l'oignon.C’est la couche qui fait face directement à l’arme pendant le bombardement. Déposer la couche pelée sur une goutte d’eau sur une lame de microscope avec une lamelle à couvrir. Mais veillez à minimiser les bulles.Observer la fluorescence de GFP ou de YFP à l’aide d’un microscope à fluorescence, comme l’axio observer zes, point Z un présenté ici en champ clair au microscope. Vérifiez d’abord la présence d’un courant cytoplasmique afin de s’assurer que les cellules sont vivantes. Pour ce faire.Exposer la lame à la lumière du champ clair pendant quelques minutes afin de réchauffer le tissu d'oignon, puis rechercher le flux cytoplasmique en mouvement. Le flux cytoplasmique n'est pas toujours facile à observer, donc ne pas se décourager s'il n'est pas clairement visible. Pour la détection en fluorescence, utiliser les filtres d'excitation et de détection appropriés pour GFP ou YFP. Vérifier également les contrôles négatifs, qui correspondent aux morceaux d'oignon transfectés avec un plasmide non fluorescent.Des signaux jaunes pâles peuvent apparaître à partir des cellules lésées, des débris et des oignons. Vérifiez également les contrôles positifs. Le plasmide contenant le rapporteur fluorescent exprimé de façon constitutive.Une fluorescence GFP est observée dans certaines cellules, mais pas dans toutes. Des bulles d'air peuvent également produire une fluorescence de fond. La présence de signaux GFP visibles dans les cellules épidermiques de l'oignon indique que les cartouches, les tissus d'oignon et le tir du canon à gènes ont été correctement préparés et réalisés.On observe ici la forte fluorescence provenant du plasmide positif 35 SGFP. La forte fluorescence est visible dans toute la cellule, y compris dans le noyau et le cytoplasme. L'image en champ clair permet de distinguer les contours correspondants des cellules et des noyaux.Toutes les cellules ne sont pas transformées. Le signal fluorescent YFP est détecté dans le noyau des cellules d'oignon lorsque la combinaison expérimentale Seuss, NYFP et L-U-H-C-Y-F-P est bombardée dans les cellules d'oignon, indiquant que Seuss, NYFP et L-U-H-C-Y-F-P interagissent in vivo. Toutefois, cette fluorescence, médiée par l'interaction, est nettement plus faible que la fluorescence médiée par 35 SGFP dans le contrôle positif.De plus, les facteurs de transcription SEUS et LUH sont localisés dans les noyaux. Ainsi, la fluorescence YFP n'est observée que dans le noyau. En outre, le nombre de cellules fluorescentes est nettement inférieur à celui du contrôle positif 35 SGFP.Cela s'explique par le fait que la B FFC ne fonctionne que lorsque les deux plasmides partenaires sont exprimés dans les mêmes cellules d'oignon. Aucun signal fluorescent n'est détecté dans les oignons bombardés avec le porte-cartouche numéro trois, contenant un mélange de puck spine, de vecteur et de L-U-H-C-Y-F-P, comme prévu pour le témoin négatif. Nous venons de vous montrer comment bombarder des cellules d'oignon afin de tester des interactions entre protéines à l'aide du système de canon à gènes BioRad Helios.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des contrôles positifs et négatifs appropriés et de savoir que la fluorescence BIFC peut être plus faible en intensité et moins nombreuse en termes de cellules fluorescentes. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Ce protocole décrit comment l'image interactions protéine-protéine en utilisant un dosage de proximité basée sur le FRET.

Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

La localisation subcellulaire des protéines est important dans la détermination de la régulation spatio-temporelle de la signalisation cellulaire. Ici, nous décrivons bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) comme une méthode simple pour le suivi des interactions spatiale des protéines dans la cellule.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Les interactions protéine-protéine sont visualisées dans les cellules avec une résolution spatiale nanométrique en combinant la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) avec la microscopie de localisation photoactivée (PALM). L’utilisation de BiFC-PALM pour l’imagerie des interactions Ras-Raf dans les cellules U2OS permet de visualiser le regroupement à l’échelle nanométrique et la diffusion de complexes Ras-Raf individuels.

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Cet article décrit une procédure expérimentale simple et rapide pour déterminer les interactions protéine-protéine basées sur la mesure de l’activité de la luciférase.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Nous avons développé une nouvelle méthode pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes à surmonter les difficultés des méthodes conventionnelles. Il prend avantage d’utiliser un plasmide d’expression unique qui contient plusieurs protéines fonctionnellement indépendant exprimant des cassettes pour atteindre la co-expression de protéine.

La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Nous présentons ici une méthode pour visualiser la formation de complexes ternaires entre trois partenaires protéiques à l’aide de protéines marquées par fluorescence par le test FRET-FLIM basé sur BiFC. Cette méthode est précieuse pour étudier les complexes d’interaction protéine-protéine in vivo.

Détermination de l’interaction tripartite entre deux monomères d’un facteur de transcription MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium par essai BiFC-FRET-FLIM

Le protocole présente une méthode de fixation covalente in vivo de la biotine à des protéines basée sur leur proximité avec une biotine ligase fusionnée à une protéine d’intérêt. Cette modification permet un enrichissement sélectif des protéines à l’aide de billes de streptavidine selon les besoins des études d’interaction protéique.

In vivo Biotinylation de proximité pour les études d’interaction protéique chez Paramecium tetraurelia

Apprenez la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) pour étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules d'oignon en utilisant le pistolet à gènes Helios. Cette méthode permet de visualiser les interactions entre facteurs de transcription in vivo.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules doignon Utilisation du pistolet à gènes Helios (Vidéo) | JoVE Journal

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d'oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

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