Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d'oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Cette procédure teste l’interaction protéique in vivo entre deux régulateurs de transcription d’Arabidopsis, seus orthographié SEU, en abrégé et lu holog ou LUH. En utilisant la complémentation de fluorescence biomoléculaire, seus est fusionné au fragment terminal final d’une protéine fluorescente jaune, ou YFP, et LUH est fusionné au fragment terminal C de Y-F-P-D-N-A des deux constructions plasmidiques. Seuss, NYFP et L-U-H-C-Y-F-P sont bombardés dans des cellules épidermiques d’oignon pour tester leur interaction.

Une interaction entre Seuss et LUH entraîne l’association des fragments terminaux terminaux et C de YFP dans les noyaux, conduisant à la fluorescence de YFP dans les noyaux. Après une incubation de 16 à 20 heures dans l’obscurité, les pelures épidermiques de l’oignon sont observées au microscope à fluorescence afin de visualiser la fluorescence. Bonjour, je m’appelle Courtney Hollander et je travaille dans le laboratoire du Dr Zhi Lu au Département de biologie cellulaire et de génétique moléculaire de l’Université du Maryland.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour tester l’interaction protéine-protéine dans les cellules d’oignon à l’aide du pistolet à gènes BioRad Helios. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour tester les interactions protéine-protéine et la localisation des protéines dans les cellules végétales. Alors commençons.

Pour commencer cette procédure, préparez des cartouches pour le pistolet à gènes Helios en suivant le protocole vidéo Joe de Woods et Zeto 2008 qui démontre en détail la procédure de préparation de la cartouche pour chaque préparation de cartouches. 50 microgrammes d’ADN plasmatique total sont mélangés avec 12,5 milligrammes de particules d’or et 0,5 milligramme par millilitre de solution PVP pour BIFC. En combinant la même préparation de cartouche, les deux ADN plasmatiques des protéines d’interaction présumées Seuss ont fusionné avec la moitié terminale N de YFP, abrégée seus, NYFP et LU Homologue ont fusionné avec la moitié terminale C de YFP abrégée L-U-H-C-Y-F-P.

La quantité combinée est de 50 microgrammes par préparation, ce qui donne jusqu’à 50 cartouches à un microgramme d’ADN pour 0,25 milligramme d’or par cartouche. Chaque cartouche est pour un coup. Après la préparation de la cartouche, testez les cartouches pour savoir si les particules d’or sont efficacement propulsées.

Enroulez un morceau carré de paraforme autour d’une boîte de Pétri. Réglez ensuite la pression de l’hélium entre 150 et 200 PSI et tirez les cartouches nouvellement fabriquées dans le carré de param. Observez les faibles particules d’or sur le parfum.

Différentes quantités de particules d’or peuvent être propulsées sur le parfum à différentes pressions d’hélium. Cependant, s’il n’y a pas de différence significative, choisissez la pression la plus basse pour le bombardement. Ce test indique également la zone couverte par chaque tir.

Pour préparer les tissus d’oignon, retirez la peau extérieure d’un gros oignon jaune à l’aide d’une lame de rasoir propre et tranchante. Coupez une zone rectangulaire de deux centimètres sur huit, profonde de quatre à cinq couches. Retirez le mouchoir rectangulaire en oignon et jetez les deux couches extérieures.

Coupez les couches restantes de l’oignon en morceaux d’environ 1,5 centimètre carré. Placez les morceaux d’oignon dans une boîte de Pétri contenant des cercles de papier filtre de trois mm. Humidifié avec de l’eau stérile, couvrez la boîte de Pétri.

Les morceaux d’oignon sont prêts à être bombardés. Tout d’abord, chargez les cartouches dans les porte-cartouches ronds blancs, chargez les cartouches contenant différentes constructions plasmidiques dans différents supports de cartouches. Chaque porte-cartouche peut contenir jusqu’à 12 cartouches pour 12 tirs.

Trois supports différents sont chargés ici. Le premier support comporte des cartouches contenant 35 S-G-F-P-A promoteur fort et constitutif du virus de la mosaïque du chou-fleur. Ce plasmide sert de contrôle positif.

Le deuxième support est chargé avec les cartouches expérimentales contenant une quantité égale de S-E-U-N-Y-F-P et L-U-H-C-Y-F-P. Le troisième porte-cartouche est chargé de cartouches contenant un mélange molaire égal du vecteur de la colonne vertébrale de la rondelle et de l’épice de rondelle LUH. Cela sert également de contrôle négatif.

Insérez la batterie et la nouvelle doublure du canon dans le pistolet à gènes Helios. Assurez-vous que la doublure du canon et le pistolet ont leurs joints toriques respectifs attachés. Ensuite, insérez un porte-cartouche vide dans le pistolet à gènes avec la marque numéro 12 sur le porte-cartouche face au haut du pistolet.

Avancez le porte-cartouche une ou deux fois pour vous assurer qu’il est correctement inséré. Fixez ensuite le pistolet au réservoir d’hélium et ajustez la pression entre 150 et 200 PS. Je porte une protection auditive et je tire plusieurs fois avec l’arme en maintenant le bouton latéral enfoncé tout en appuyant sur la gâchette. En tirant avec le porte-cartouche vide, il est chargé pour nettoyer la chambre du pistolet et s’assurer que la pression est stable.

Avant de tirer sur l’ADN, tirer un morceau d’oignon ici peut être un contrôle négatif pour la fluorescence de fond. Pour tirer sur les particules d’or recouvertes d’ADN, retirez le support de cartouche vide et insérez le premier support de cartouche chargé contenant la commande positive. Avancez le porte-cartouche de manière à ce que la cartouche destinée au tir soit positionnée au bas du porte-cartouche.

Placez maintenant les morceaux d’oignon au milieu d’une boîte de Pétri vide avec la couche la plus interne de l’oignon vers le haut. Posez la doublure du canon du pistolet à gènes sur la boîte de Pétri et tirez avec le pistolet. Passez à la cartouche suivante et tirez un autre morceau d’oignon.

Répétez cette étape jusqu’à ce que quatre à cinq morceaux d’oignon soient abattus. Chaque morceau d’oignon n’est abattu qu’une seule fois après le tir. Transférez le morceau d’oignon bombardé dans une boîte de Pétri contenant du papier filtre humide de trois mm pour tirer les cartouches expérimentales.

Passez à la cartouche Holden. Deuxièmement, n’oubliez pas de changer la doublure du canon pour éviter toute contamination. Tirez sur quatre à cinq morceaux d’oignon comme indiqué ci-dessus pour le contrôle positif.

Passez ensuite à la cartouche Holden. Numéro trois, contenant l’ADN de contrôle négatif. Et encore une fois, tirez sur quatre à cinq morceaux d’oignon.

Changez la doublure du canon pour éviter toute contamination. Après le bombardement. Couvrez les boîtes de Pétri contenant les morceaux d’oignon avec des couvercles.

Enveloppez-les de paraform pour éviter le dessèchement. Incuber les morceaux d’oignon à température ambiante dans l’obscurité pendant 16 à 48 heures. Une fois le bombardement terminé, coupez le gaz et relâchez la pression avant de détacher le pistolet à gènes du réservoir d’hélium, dévissez la doublure du canon et retirez le porte-cartouche et les cartouches utilisées.

Enfin, nettoyez les porte-cartouches et les doublures du canon en les immergeant dans un bécher avec de l’eau savonneuse et du sonique. Pendant 20 minutes. Ensuite, rincez à l’eau pour éliminer tous les résidus de savon.

Faites tremper dans de l’éthanol à 70 % pendant une heure, puis séchez sur du papier absorbant. Procédez à l’observation des morceaux d’oignon 16 à 20 heures après le bombardement. Après avoir incubé les morceaux d’oignon bombardés pendant 16 à 20 heures à température ambiante, utilisez une pince à extrémités plates pour retirer lentement une seule couche cellulaire de l’épiderme interne de l’oignon.

C’est la couche qui fait directement face au canon pendant le bombardement. Placez la couche pelée sur une goutte d’eau sur un couvercle de diapositive avec une lamelle. Mais attention à minimiser les bulles.

Observez la fluorescence GFP ou YFP à l’aide d’un microscope à fluorescence tel que le zes axio observer, le point Z un montré ici sous le champ clair du microscope. Vérifiez d’abord l’écoulement cytoplasmique pour vous assurer que les cellules sont vivantes. Pour ce faire.

Exposez la lame à la lumière du champ vif pendant quelques minutes pour réchauffer le tissu de l’oignon, puis recherchez les plastiques en mouvement Le flux cytoplasmique n’est pas toujours facile à voir, alors ne vous découragez pas s’il n’est pas clairement visible. Pour la détection de fluorescence, utilisez des filtres d’excitation et de détection appropriés pour GFP ou YFP. Vérifiez également les commandes négatives, qui sont les morceaux d’oignon tirés avec un plasmide non fluorescent.

De faibles signaux jaunes peuvent apparaître provenant de cellules blessées, de débris et d’oignons. Vérifiez également les commandes positives. Plasmide contenant un rapporteur fluorescent exprimé de manière constitutive.

La fluorescence de la GFP est observée dans certaines cellules, mais pas dans toutes. Les bulles d’air peuvent également produire une fluorescence de fond. Les signaux GFP visibles des cellules épidermiques de l’oignon indiquent que les cartouches, les tissus de l’oignon et le tir du pistolet à gènes sont correctement préparés et exécutés.

La forte fluorescence observée à partir du plasmide positif à 35 SGFP est illustrée. La forte fluorescence est observée dans toute la cellule, y compris le noyau et le cytoplasme. L’image en fond clair permet de voir le contour correspondant des cellules et des noyaux.

Toutes les cellules ne sont pas transformées. Le signal fluorescent YFP est détecté dans le noyau de la cellule d’oignon lorsque la combinaison expérimentale Seuss, NYFP et L-U-H-C-Y-F-P est bombardée dans des cellules d’oignon, ce qui indique que Seuss NYFP et L-U-H-C-Y-F-P interagissent in vivo. Cependant, cette fluorescence médiée par interaction est significativement plus faible que la fluorescence médiée par 35 SGFP dans le témoin positif.

De plus, les facteurs de transcription SEUS et LUH sont localisés dans les noyaux. Ainsi, la fluorescence YFP n’est observée que dans le noyau. De plus, le nombre de cellules fluorescentes est nettement inférieur à celui du témoin positif à 35 SGFP.

En effet, le FFC B ne fonctionne que lorsque les deux plasmides partenaires sont exprimés dans les mêmes cellules d’oignon. Aucun signal fluorescent n’est détecté dans les oignons, bombardés par le porte-cartouche numéro trois contenant un mélange de rondelle, de spine, de vecteur et de L-U-H-C-Y-F-P Comme on s’y attend du témoin négatif. Nous venons de vous montrer comment bombarder des cellules d’oignon pour tester les interactions protéiques à l’aide du système de pistolet à gènes BioRad Helios.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des contrôles positifs et négatifs appropriés et de savoir que la fluorescence BIFC peut être plus faible en signal et moins en nombre de cellules fluorescentes. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.