Name: Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Apprenez à dériver des cellules souches trophoblastiques à partir de blastocystes de souris et à maintenir leurs propriétés souches en culture. Cette méthode permet d'étudier le développement placentaire et la différenciation cellulaire.

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Les auteurs remercient Janet Rossant pour le protocole initial. Cette étude a été soutenue par l&#39;Institut national de la Santé accorde CA106308 à WH.

Dans ce protocole, nous décrivons la préparation de blastocystes de souris et de la création de lignées de cellules TS. Manipulations de souris générale préalable à la collecte de blastocystes, y compris la mise en place pour l'accouplement naturel et l'induction de l'ovulation super, essentiellement suivi le protocole standard illustré par Nagy et al. 2003 (pp146-150). Dérivation et la maintenance des cellules TS <ol><li> Croisées entre les souris d'élevage de configuration d'intérêt. </li><li> Préparer les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) en tant que cellules nourricières. Deux jours avant la collecte des blastocystes, FAE (2 x 10 6 cellules) sont étalées dans des boîtes de 100 mm. Le lendemain, ces cellules sont traitées avec 10 ml de milieu de TS contenant la mitomycine C (20 mg / ml) pendant 2 heures d'incubation à 37 ° C, 5% de CO 2. Il est suivi par un lavage des cellules deux fois avec du PBS. Les cellules mitomycine C traitées sont ensuite ensemencées dans des plaques 12 puits (1 x 10 5 cellules / puits). </li><li> Le jour de la collecte de blastocyste (3,5 jpc, appelé le premier jour), un milieu de culture est remplacé par le MEF TS moyenne plus de 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / puits). </li><li> Préparation pour la collecte de l'utérus: euthanasier la souris et de localiser l'utérus (figure 1A). </li><li> Enlever l'utérus en la saisissant avec une pince à col de l'utérus (situé derrière la vessie) et couper à travers la jonction de l'utérus et du col utérin (figure 1B). Tirez l'utérus, les garnitures de la membrane et les tissus adipeux loin et couper l'utérus en dessous de la jonction avec l'oviducte (figure 1C). Placez le col (figure 1D) dans un petit volume (0,2 ml) du milieu TS dans une plaque de 60 mm. </li><li> Rincer chaque corne utérine avec 1 ml de milieu de TS à l'aide d'une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 26. Insérez l'aiguille dans la base de l'utérus et rincer lentement dans une nouvelle plaque de 60 mm avec une moyenne TS ml. L'utérus doit être gonflé et étendu intégralement pendant le rinçage. </li><li> Recueillir et le transfert des blastocystes avec précaution dans un endroit propre plaque 12 puits contenant du milieu TS à l'aide d'une pipette bouche-contrôlé. Lavez blastocystes à trois reprises par le transfert de série par le biais du milieu TS en plaques de 12 puits. Placez un blastocyste par puits (figure 2A) dans une plaque de 12 puits contenant les mitomycine C-traitée mangeoires MEF et la culture à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Les blastocystes éclosent à partir zone pellucide et joindre les puits de 24 à 36 heures. Une petite excroissance être facilement observée le jour 3. Nourrissez les cultures avec 500 ul du milieu TS frais plus 1x FGF4/Heparin. </li><li> Au jour 4 ou 5, l'excroissance blastocyste devrait être prêt pour la ventilation en fonction de sa taille. La taille idéale pour la désagrégation des cellules TS est illustré dans la figure 3B. Laver les cultures une fois avec 0,5 ml de PBS. Ajouter 100 ml 0,25% de trypsine / EDTA et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C, 5% de CO 2. Pause dans l'excroissance de petites touffes d'aspiration et refoulement vigoureusement avec une pipetteman P100. Arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant le TS-70CM-1.5F4H (milieu TS 30%, 70% MEF-CM, plus FGF4/Heparin 1.5x) dans le puits. Changer moyenne 8 heures après la désagrégation et de continuer à nourrir les cellules tous les 2 jours. </li><li> Entre les jours 6 et 10 (très variable) des colonies de cellules TS peuvent être observés. Ils ont plat, drap, comme la morphologie épithéliale avec une frontière claire colonie (figure 2C). Continuer à alimenter les cultures tous les 2 jours </li><li> Lorsque les cellules atteignent la confluence TS de 50% (généralement entre 15 et 20 jours), se laver une fois avec du PBS et ajouter 100 ml 0,25% de trypsine / EDTA. Pipeter haut en bas durant trypsinisation pour assurer une proximité unique de cellules en suspension. Arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant le TS-70CM-1.5F4H et le transfert de nouvelles plaques de 6 puits ou 60mm contenant la mitomycine C-traitée mangeoires MEF (2,5 x 10 5 cells/6-well ou 5 x10 5 cells/60mm plaque). </li><li> Changer moyenne 8 heures après le passage et continuer à nourrir les cultures tous les 2 jours. </li><li> Après un ou deux passages plus (3-5 jours entre les passages) sur les départs du MEF, les cellules peuvent être cultivées TS sans eux. Parce MEFs attacher à la plaque de culture beaucoup plus vite que les cellules TS après trypsinisation, une telle différence dans le taux adhérentes peuvent être utilisées pour séparer les cellules TS à partir des mangeoires MEF. Après le passage des cellules cultivées, les incuber à 37 ° C CO, 5% 2 pendant 30 min. La plupart des FAE se joindre à la plaque et la population TS reste en suspension. Transférer le surnageant dans une nouvelle plaque. Répétez ce processus pour plusieurs passages pour obtenir une population TS pur. </li><li> Maintenir les cellules TS dans le TS-70CM-1.5F4H et les passer tous les 4 jours (1:10-1:20 split) ou lorsque la culture atteint 70% de confluence. Passant les cellules à haute densité (supérieure à diviser 01h05) ou en les cultivant en trop confluentes peut provoquer leur différenciation. </li><li> L'identité des cellules TS peut être confirmée par immunomarquage d'un marqueur de cellule, Cdx2 (figure 3). </li></ol> TS cellules de congélation <ol><li> Préparer 2x milieu de congélation (50% de FBS, 30 moyennes TS% et 20% de DMSO). </li><li> Cocellules TS llect par trypsinisation, suivie par une centrifugation à 450g pendant 6 min. Les remettre en suspension dans un milieu de TS avec un volume égal de milieu de congélation 2x. </li><li> Congelez les cellules lentement en utilisant une chambre de l'alcool isopropylique à -70 ° C et transfert à l'azote liquide après 24-48 heures. </li><li> Une plaque de 60 mm (70% de confluence) est habituellement conservée dans deux flacons. </li></ol> La décongélation des cellules TS <ol><li> Vite dégeler le flacon à 37 ° C, les recueillir dans 10 médias TS ml par centrifugation (450g, 6 min), et remettre en suspension dans 30% TS médias, 70CM-1.5F4H. </li><li> Un flacon de cellules est ensemencé dans une plaque de 60 mm. </li></ol> Différenciation des cellules TS en TGC La différenciation des cellules TS en cellules géantes du trophoblaste (PGT) peut être induite par le retrait du MEF-CM, FGF4 et l'héparine. Le phénotype TGC (gros noyaux) peut être détecté quatre jours après l'induction (Tanaka et al., 1998 et Chiu et al. 2008). Immunocoloration des P450scc détecter l'expression de ce marqueur TGC dans la culture différenciés (figure 4A). Cytométrie de flux IP (iodure de propidium) cellules colorées montre en outre la présence de cellules différenciées contenant plus forte teneur en ADN (figure 4B). Ces résultats suggèrent que les cellules subissent TS endoréduplication devenir TGC polyploïdes. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Dissection de l'utérus de la souris. (A) Situation de l'utérus est indiqué par des flèches. (B) Couper à travers la jonction de l'utérus et le col comme indiqué. (C) Couper l'utérus juste en dessous de l'oviducte (DO) au-dessous de l'ovaire (VO). (D) Image de l'utérus. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Images représentant la figure 2. Illustrent blastocyste de souris, excroissance blastocyste et la colonie du trophoblaste. (A) un blastocyste de souris recueillies à E3.5 est montré. ICM, la masse cellulaire interne, MT, trophectoderme mural; PT, trophectoderme polaire. (B) une excroissance du trophoblaste sur les départs du MEF est montré. TS, cellules souches trophoblastiques. (C) Une colonie de cellules souches trophoblastiques montre un net avantage sur les départs du MEF. Les flèches indiquent les limites des cellules. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Identification des cellules TS par immunomarquage analyse. TS (AD) et ES (contrôle, EH), les cellules sont soumises à l'identification des marqueurs. Les cellules sont immunocolorés avec des anticorps de reconnaître Oct4 (A, E) ou Cdx2 (B, F), et contre par DAPI (C, G) a présenté en images fusionnées (D, H). La barre d'échelle, 50 um. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Différenciation des cellules TS in vitro. (A) indifférenciées (Undiff) ou différenciés (Diff) de cellules en culture ont été examinés pour l'expression d'un marqueur de TGC, P450scc (vert), de contraste avec DAPI (en rouge). (B) Analyse par cytométrie en flux des cellules différenciées, tachée de PI, le contenu des mesures ADN (M1, deux à quatre exemplaires, M2, plus de quatre exemplaires). La population M2 représente les cellules trophoblastiques polyploïdes.

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons le processus de collecte E3.5 blastocystes à partir des procédures de l&#39;utérus et d&#39;expérimentation pour établir des lignées de cellules TS. Nous décrivons également la condition de maintenir le caractère souche de cellules TS et d&#39;induire leur différenciation en cellules différenciées. Deux étapes essentielles pures pour obtenir des lignées de cellules TS sont le moment de la désagrégation prolongement (étape 9) et le traitement du premier passage (étape 11). Il a été rappo...

Réactifs Milieu TS: RPMI-1640, 20% de FBS, 1 mM pyruvate de sodium, 100 mM de bêta-mercaptoéthanol et 100 mg / ml de pénicilline-streptomycine. Mitomycine C: Dissoudre 2 mg de mitomycine C (Sigma M-0503) dans 2 ml de PBS et ajouter ce mélange de 2 ml dans 200 ml TS moyenne (10 ng / ml). Faire 20 aliquotes (10 ml) et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. Ajouter une aliquote par 100 mm Plaque. Fibroblastes embryonnaires de souris-état moyen (MEF-CM): Plaque de MEFs plaques de 100 mm (1 x 10 6 / plaque). Le lendemain, ajoutez 10 ml TS moyenne par plat et continuer à la culture pendant 48 heures. Recueillir le milieu de culture, de les filtrer (0,45 mm) et conserver à -20 ° C dans 35 ml aliquotes. Dégel chaque aliquote lorsque cela est nécessaire, qui peut être conservé à 4 ° C. La FAE peut être utilisé pour préparer plus de deux lots de CM avant qu&#39;ils ne deviennent confluentes. PBS / BSA: Dissoudre BSA fraction, V (Sigma A3311, 0,1% (p / v)) dans du PBS (10 ml), filtrer à travers un filtre de 0,45 mm seringue et faire des aliquotes de 1 ml dans des tubes de 1,5 ml. Stocker à -70 ° C et le dégel d&#39;un tube en cas de besoin pour préparer FGF4. FGF4 (1000x): Resuspendre lyophilisé FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) avec 1 ml de la solution de PBS / BSA. Mélangez bien et faites des aliquots de 10 (100 ml) dans des tubes de 1,5 ml et conserver à -70 ° C. Dégel chaque tube en cas de besoin et de stocker le reste à 4 ° C, ne pas recongeler. Diluer 1000 fois dans du milieu TS pour obtenir 1x FGF4 (25 ng / ml). L&#39;héparine (1000x): Resuspendre héparine (Sigma H3149, 10.000 unités) dans du PBS à une concentration finale de 1 mg / ml (1000x). Faire des aliquots de 100 ml dans des tubes de 1,5 ml et conserver à -70 ° C. Aliquotes dégel si nécessaire et stocker le reste à 4 ° C, ne pas recongeler. Diluer 1000 fois dans le milieu de TS pour obtenir 1x héparine (1 ng / ml).

dérivation de cellules souches de la souris trophoblast à partir de blastocystes

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Spécification du trophectoderme est l&#39;un des événements les plus anciens de différenciation du développement des mammifères. La lignée dérivée de trophoblaste trophectoderme médie l&#39;implantation et génère la partie foetale du placenta. En conséquence, le développement de cette lignée est essentielle pour la survie des embryons. Dérivation de la tige du trophoblaste (TS), les cellules à partir de blastocystes de souris a été décrite par Tanaka<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. La capacité des cellules TS afin de préserver la propriété trophoblaste spécifiques et leur expression de la scène et du type de cellules de marqueurs spécifiques après stimulation adéquate fournit un système modèle intéressant d&#39;étudier le développement lignée trophoblaste lequel récapitulant les événements placentation tôt. Par ailleurs, les cellules trophoblastiques sont l&#39;un des rares types de cellules somatiques en cours d&#39;amplification du génome naturel. Bien que les voies moléculaires qui sous-tendent polyploïdisation du trophoblaste ont commencé à se dénouer, le rôle physiologique et l&#39;avantage de l&#39;amplification du génome du trophoblaste reste largement insaisissable. Le développement des cellules souches diploïdes dans les cellules trophoblastiques polyploïdes dans la culture fait de ce<em&gt; Ex vivo</emSystème&gt; un excellent outil pour élucider le mécanisme de régulation de la réplication du génome et de l&#39;instabilité dans la santé et la maladie. Nous décrivons ici un protocole basé sur les rapports antérieurs à la modification publiée dans Chiu<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;isolement des blastocystes de souris et de la dérivation de cellules souches trophoblastiques à partir de blastocystes. Nous décrivons également les conditions d&#39;entretien de la propriété de cellules souches ainsi que l&#39;induction de la différenciation en culture.

Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes

La spécification du trophectoderme est l'un des premiers événements de différenciation du développement mammalien. La lignée trophoblastique dérivée du...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des cellules TS à partir de blastocystes de souris. Cela est réalisé en isolant d'abord les cornes utérines et en récupérant les blastocystes chez des souris gestantes. La deuxième étape de la procédure consiste à cultiver les blastocystes sur des fibroblastes de souris traités au mitomycine C, dans des conditions favorisant la croissance des cellules TS.La troisième étape de la procédure consiste à étendre les colonies de cellules TS et, éventuellement, à cultiver les cellules TS en l'absence de cellules nourricières méthyliques. La dernière étape de la procédure est de cultiver les cellules TS tout en maintenant leurs propriétés de cellules souches, afin de réaliser une cryoconservation et d'induire une différenciation en trophoblaste. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant l'expression d'un marqueur de cellule souche trophoblastique, à savoir CDX2, dans les cellules TS non différenciées, ou l'expression d'un marqueur de différenciation, à savoir P450 SCC, après leur maturation en cellules géantes trophoblastiques, par microscopie immunofluorescente.Bonjour, je suis Shani Chu du laboratoire du Département de gé

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