Analyse de l'expression génique dans l'agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser l'expression génique dans les tissus et les stades de développement du Boer du frêne émeraude à l'aide de la PCR quantitative. Cela est réalisé par la dissection des tissus larvaires et la catégorisation des stades de développement. Dans un deuxième temps, extraire l'ARN à partir des tissus et des stades de développement à l'aide du réactif triol, qui est ensuite utilisé comme matrice pour générer le brin complémentaire d'ADN, l'ADNc, suivie de la synthèse du brin complémentaire d'ADNc ; la qRT-PCR est ensuite effectuée.

Des résultats sont obtenus qui montrent une expression différentielle du gène cible dans divers tissus larvaires et stades de développement, en se basant sur les données complètes de variation obtenues à partir des valeurs de seuil de cycle après amplifications R-T-P-C-R quantitatives. Bonjour, je suis Prakash Mi, le chercheur principal de ce laboratoire au Département d'entomologie de l'Université d'État de l'Ohio.

Notre laboratoire étudie principalement les aspects génomiques ou moléculaires des interactions entre l'émale, le larve, le bupreste et le frêne. L'émale, le larve, le bupreste ou EAB (Agrilus planipennis) est un ravageur exotique envahissant originaire de Chine qui menace l'existence même des populations de frênes en Amérique du Nord. Aujourd'hui, nous allons vous présenter un protocole d'analyse de l'expression génique dans l'EAB en utilisant la PCRq ou PCR quantitative en temps réel.

Et les membres du laboratoire qui participeront à ce protocole sont Swapna Priou, qui effectuera les dissections des valves, puis Bin Bandari, qui montrera l'isolement de l'ARN. Enfin, Lauren Rivera Vega s'occupera de l'analyse de QPC. Nous utilisons également cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'expression génique de l'ash.

Commençons donc. Avant le début de cette procédure, placez les larves d’agrile du frêne émeraude B ou EAD sur du papier absorbant humide. Conservez au froid, sur de la glace, du chlorure de sodium tamponné au phosphate fraîchement préparé à 1 x, ou PBS, jusqu’à ce que les dissections soient réalisées, afin de maintenir le tampon froid pendant toute la durée de la dissection.

Pour commencer, fixez les larves de DED sur la plaque de dissection à l'aide d'épingles de dissection fines. Ajoutez ensuite du PBS 1X froid sur la plaque de dissection. Découpez d'abord la tête des larves à l'aide d'une paire de ciseaux de dissection fine.

Ensuite, retirez le dernier segment abdominal des larves à l’aide d’une pince de bijoutier. Soulevez la cuticule du cadavre larvaire, puis pratiquez une incision le long du cadavre à l’aide d’une paire de ciseaux. Veillez à ne pas rompre l’intestin.

Lorsque l'incision est effectuée, isoler soigneusement le tissu du mésentère des autres tissus, tels que les corps gras et le tissu conjonctif. Rincer ensuite le tissu dans 1 ml de tampon PBS 1× frais afin de s'assurer qu'il n'y a aucune contamination par le corps gras. Transférer le mésentère dans 500 microlitres de réactif TRIol prérefroidi dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre.

Ensuite, isolez le tissu du corps gras à l’aide de pinces et transférez-le dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de réactif Triol refroidi. Enfin, isolez le tissu de la cuticule à partir du cadavre larvaire en grattant soigneusement tout tissu adhérent, sans nuire à l’intégrité du tissu.

Rincez le tissu de cuticule isolé dans du tampon PBS frais et transférez-le dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de réactif de triazole refroidi. Les tissus isolés de corps gras, de cuticule et de tube digestif moyen peuvent être conservés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'extraction de l'ARN. En prévision de l'extraction de l'ARN, triez les différents échantillons de PSB selon les stades de développement.

Ces stades comprennent le premier, le deuxième, le troisième et le quatrième stade chez les étoiles, les PrepU et les adultes. Pour commencer l'extraction d'ARN, homogénéisez d'abord les tissus dans le triol contenu dans des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre à l'aide de baguettes en plastique. Après homogénéisation, ajustez le volume total de chaque échantillon à un millilitre avec le réactif triol.

Pour les stades de développement, homogénéisez l'animal entier dans de l'azote liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon. Ajoutez ensuite un aliquot de l'homogénat à un millilitre de triol. Incubez les tubes d'échantillons avec un millilitre de triol pendant 15 minutes à température ambiante.

Après l'incubation, ajouter immédiatement 200 microlitres de chloroforme à chaque tube après l'ajout de chloroforme. Agiter vigoureusement les tubes pendant environ 15 secondes. Puis incuber les tubes à température ambiante pendant deux à trois minutes supplémentaires.

Ensuite, centrifuger les échantillons à 12 000 ×g pendant 15 minutes à deux degrés Celsius. Après la centrifugation, l'ARN se trouvera dans la phase aqueuse. Le volume de la phase aqueuse doit être de 600 microlitres ou 60 % du volume total de triol.

Retirez soigneusement uniquement la phase aqueuse. La présence de substances sous la phase aqueuse entraînera une contamination de l'ARN extrait. Transférez ensuite la phase aqueuse dans un tube einor de 1,5 millilitre correctement étiqueté.

Pour précipiter l'ARN à partir de la phase aqueuse, ajouter 0,5 millilitre d'alcool isopropylique à chaque tube. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l'incubation, centrifuger les tubes à 12 000 G pendant 10 minutes à deux degrés Celsius. Après la centrifugation, éliminer le surnageant des tubes.

L'ARN est présent dans le culot de type gélatineux formé au fond du tube. Laver le culot avec de l'éthanol à 75 %, en ajoutant au moins un millilitre d'éthanol à 75 % par millilitre de mélange, en vortexant. Puis centrifuger les tubes à 7 500 ×g pendant cinq minutes à deux degrés Celsius.

Jetez le surnageant des tubes. Centrifugez à nouveau les tubes dans la centrifugeuse de table pendant une minute. Éliminez tout excès de surnageant du tube par pipetage soigneux.

Laissez le tube ouvert et laissez sécher l'air du culot pendant cinq à dix minutes. Veillez à ne pas trop dessécher le culot, car cela réduirait considérablement sa solubilité après le séchage à l'air. Resuspendez le culot dans du dathyl percarbonate ou de l'eau traitée dep sea.

La quantité d'eau utilisée pour resuspendre le culot dépendra de la taille du culot. Utilisez 50 microlitres d'eau de mer traitée sans DNase pour un petit culot ou 100 microlitres pour un gros culot. Laissez le culot se dissoudre complètement dans l'eau de mer traitée sans DNase en déplaçant plusieurs fois la pointe de pipette vers le haut et vers le bas.

Une fois que le culot est dissous, placez l'échantillon à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, mesurez la concentration de chaque échantillon d'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop. Enfin, effectuez la synthèse de l'ADN de premier brin pour les échantillons d'ARN respectifs en utilisant le système de synthèse de premier brin SuperScript d'Invitrogen pour la RT-PCR.

Cette procédure est décrite dans la partie écrite de ce protocole. Pour commencer la conception de la PCR quantitative en temps réel ou Q-R-T-P-C-R, concevoir chaque amorce afin qu'elle ait une température de fusion de 60 degrés Celsius et une taille de produit d'environ 100 paires de bases. AP par un est utilisé comme gène d'intérêt pour cette expérience.

Un gène de référence ou contrôle interne est nécessaire pour l'analyse ultérieure et la normalisation des données. Ici, la protéine ribosomique a P RRP un est utilisée comme gène de référence. Ensuite, concevoir un modèle indiquant le nom de l'échantillon pour chaque puits et la plaque de qPCR.

N'oubliez pas d'inclure des standards pour chaque gène et au moins deux réplicats techniques par échantillon. Ensuite, allumez la machine de PCR quantitative en temps réel et saisissez les paramètres de cyclage pour configurer la plaque pour la machine CFX 96. Préparez d'abord le mélange maître pour chaque gène dans un tube séparé pour chaque puits.

Le mélange maître est composé de deux microlitres d'eau sans nucléase, de quatre microlitres de cyber vert 2,5 x, d'un microlitre d'amorce avant et d'un microlitre d'amorce arrière, pour un volume total de huit microlitres. Selon le modèle précédemment conçu, ajouter deux microlitres d'ADNc à chaque puits. Ensuite, ajouter huit microlitres du mélange maître dans chaque puits, obtenant ainsi un volume total de 10 microlitres par réaction ; pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de s'assurer que l'échantillon est bien homogénéisé.

Vérifiez qu'aucun liquide ne reste sur l'embout. Pour éviter toute contamination croisée, utilisez un nouvel embout pour chaque échantillon. Une fois la plaque entièrement préparée, recouvrez-la d'un ruban optique.

Évitez de toucher le ruban car la présence de graisse peut affecter la lecture. Ensuite, centrifugez la plaque à 500 tr/min pendant une minute afin de s'assurer que tous les produits présents dans les puits se trouvent au fond de la plaque après la centrifugation. Vérifiez qu'il n'y a ni glace ni eau au fond de la plaque.

Enfin, placez la plaque dans la machine de PCR en temps réel QR et lancez le programme de PCR représentatif pour les larves de l'agrile du frêtier. La dissection et la PCR en temps réel QR sont illustrées ici. La dissection de la larve de l'agrile du frêtier devrait révéler le tube digestif moyen au centre de la larve.

L'intestin moyen de la larve de PSB est isolé comme illustré ici, avec les valeurs moyennes d'expression relative ou VRE. Les valeurs pour le gène de la paratrophine AP par un sont indiquées ici pour différents tissus larvaires, incluant la cuticule, l'intestin moyen et les corps gras. La protéine ribosomique spécifique du PSB ARP un a été utilisée comme témoin interne pour normaliser les données obtenues pour le gène d'intérêt.

Le changement relatif du nombre de copies de AP AP par un a été extrait pour les différents tissus larvaires. Le tissu de cuticule a montré la plus faible expression et a donc été pris comme échantillon témoin pour les moyennes RV de AP Perry. Un dans différents stades de développement du PSF, incluant les premiers, deuxièmes, troisièmes et quatrièmes stades larvaires.

Les échantillons de PrepU et d'adultes ont été déterminés en utilisant aprp one comme témoin interne pour normaliser les données. Le changement relatif du nombre de copies d'AP Perry one a été déterminé pour différents stades de développement. Ici, l'échantillon PrepU a montré le niveau d'ARNm le plus faible et a donc été utilisé comme échantillon calibrateur.

Nous venons de vous montrer comment réaliser des dissections latérales et, par la suite, une analyse d'expression génique à partir des régions latérales, ainsi que de divers stades de développement d'Emeral ra, en utilisant la RT-q-PCR. Vous devez faire attention lors de la dissection afin d'éviter toute contamination croisée des échantillons de tissus. De plus, il est essentiel de manipuler avec précaution lors de la réalisation de la RT-q-PCR afin de pipeter chaque échantillon dans le puits PCR correspondant.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé notre vidéo et bonne chance avec vos expériences.