Name: Analyse de lexpression génique dans lagrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Apprenez l'analyse d'expression génique chez l'agrile du frêne (Agrilus planipennis) par qRT-PCR sur tissus larvaires et stades de développement. Cette méthode quantifie les niveaux d'ARNm pour comprendre la biologie de cet insecte invasif.

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Nous reconnaissons l&#39;aide fournie par Lourdes Delta Antequera Arrueta (département d&#39;entomologie, Université Ohio State / OARDC, Wooster, OH) dans la configuration de l&#39;expérimentation. Nous remercions le Dr Thérèse Pologne (USDA, Forest Services, ORA) pour envoyer des échantillons EAB larvaire. Aide fournie par le Dr Luis Un Canas et Nuris M Acosta avec la configuration de microscope est apprécié. Le financement de ce projet a été assuré par des fonds d&#39;État et fédéraux affectés au Centre de l&#39;Ohio Agricultural Research and Development, The Ohio State University.

Le protocole complet avec les différentes étapes est représenté dans l'organigramme de la figure 1. Étapes individuelles constituant dissection, extraction d'ARN, synthèse du premier brin d'ADNc et QRT-PCR sont détaillées ci-dessous. I. Dissection des larves <ol><li> Avant le début de cette procédure, l'agrile du frêne émeraude lieu, ou l'agrile du frêne, de larves sur du papier absorbant humide jusqu'à ce que les dissections sont réalisées. Gardez fraîchement préparés phosphates 1X saline tamponnée, ou PBS, sur la glace pour garder le froid à travers la dissection de tampon. </li><li> Pour commencer, fixer les larves EAB sur la plaque de dissection avec des épingles de dissection fine. Ensuite, ajoutez à froid du PBS 1X à la plaque de dissection. </li><li> Tout d'abord, de décapiter les larves avec une belle paire de ciseaux de dissection. Par la suite supprimer le dernier segment abdominal de la larve. </li><li> En utilisant une paire de forceps horloger, soulèvent la cuticule des larves de la carcasse. Ensuite, faire une incision sur toute la longueur de la carcasse à l'aide d'une paire de ciseaux. Prenez soin de ne pas rompre l'intestin que l'incision est faite. </li><li> Soigneusement isoler les tissus de l'intestin moyen d'autres tissus tels que les organismes de graisse et de tissu conjonctif. Ensuite, rincer le tissu dans l'eau douce 1X tampon PBS afin d'assurer qu'il n'y ait pas de contamination de fatbody. Transfert de l'intestin moyen isolé à 500 pi de pré-réfrigérée réactif Trizol dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Ensuite, d'isoler le tissu de graisse du corps en utilisant une pince et le transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 500 ul de réactif Trizol réfrigérée. </li><li> Enfin, isoler le tissu cuticule des larves de la carcasse par voie de démolition hors tout tissu adhérant, en prenant soin de ne pas endommager l'intégrité des tissus. Rincez le tissu cuticules isolées dans l'eau douce du tampon PBS et le transférer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf avec 500 uL de réactif Trizol réfrigérée. </li><li> Les isolés graisses des tissus du corps, cuticule et l'intestin moyen peut être conservé à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN. </li><li> En préparation pour l'extraction d'ARN, de trier les échantillons EAB différents selon les stades de développement. Ces étapes comprennent 1re, 2e, 3e et 4e stades larvaires, prénymphes et les adultes. </li></ol> II. Extraction des ARN (comme le protocole du fabricant pour l'utilisation de s réactif Trizol) Homogénéisation <ol><li> Pour commencer l'extraction d'ARN, la première utilisation de pilons en plastique afin d'homogénéiser les tissus dans le Trizol contenant tubes Eppendorf de 1,5 ml. Après homogénéisation, porter le volume total de chaque échantillon ML à1 avec le réactif Trizol. </li><li> Pour les stades de développement, d'homogénéiser l'ensemble des animaux dans l'azote liquide avec un mortier et un pilon. Puis ajoutez une aliquote de l'homogénat (50 ug) à 1 ml de Trizol. </li></ol> Séparation de phases: <ol start="3"><li> Incuber les tubes d'échantillon avec 1 ml Trizol pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Après incubation, ajouter 200 ul de chloroforme dans chaque tube. Immédiatement après l'ajout de chloroforme, agiter le tube vigoureusement pendant environ 15 secondes. Puis, incuber les tubes à température ambiante pendant une 2-3 minutes supplémentaires. </li><li> Ensuite, centrifuger les échantillons à 12.000 xg pendant 15 minutes à 2 ° C. Après centrifugation, l'ARN sera dans la phase aqueuse. Le volume de la phase aqueuse devrait être de 600 pi, soit 60% du volume total de Trizol. </li></ol> ARN précipitations <ol start="6"><li> Retirez soigneusement que la phase aqueuse. Présence de substances en dessous de la phase aqueuse provoque la contamination de l'ARN extrait. Ensuite, le transfert de la phase aqueuse dans un tube convenablement étiquetés Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Pour précipiter les ARN à partir de la phase aqueuse, mélanger 0,5 mL d'alcool isopropylique à chaque tube. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l'incubation, centrifuger les tubes à 12 000 xg pendant 10 minutes à 2 ° C. </li></ol> Laver l'ARN <ol start="8"><li> Après la centrifugation, éliminer le surnageant des tubes. L'ARN est présente dans le culot gélatineux formé au fond du tube. Laver le culot avec de l'éthanol à 75%, en ajoutant au moins 1 mL d'éthanol à 75% pour 1 ml de Trizol. Mélanger au vortex. Puis, centrifuger les tubes à 7500Xg pendant 5 minutes à 2 ° C. </li></ol> ARN élution <ol start="9"><li> Jeter le surnageant des tubes. Centrifuger les tubes à nouveau dans la centrifugeuse petite table pendant 1 minute. Retirez tout excès de surnageant du tube par pipetage prudent. Laisser le tube ouvert et laissez l'air granulés secs pendant 5-10 minutes. Soyez prudent de ne pas trop sécher les granulés car cela réduira considérablement sa solubilité. </li><li> Après séchage à l'air, resuspendre le culot dans <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diéthylpyrocarbonate</a> ou DEPC, l'eau traitée. La quantité d'eau utilisée pour resuspendre le culot va dépendre de la taille de la pastille. Utiliser 50 uL d'eau traitée au DEPC pour un smtous les granulés ou 100 uL d'une boulette de gros. Laissez le culot dissoudre complètement dans l'eau traitée au DEPC en déplaçant la pointe de la pipette de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Une fois le culot est dissous, placer l'échantillon à 55 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Ensuite, mesurer la concentration de chaque échantillon d'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop (2 pl de l'échantillon d'ARN). </li><li> Stocker les échantillons d'ARN à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. </li></ol> III. Premier brin d'ADNc de synthèse (comme le protocole du fabricant s en utilisant SuperScript trousse de premiers brins de synthèse par Invitrogen). <ol><li> Pour chaque échantillon d'ARN ajoutez la ligne suivante dans un tube PCR: <table border="0"><tbody><tr><td> ARN </td><td> ul x </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mélange M </td><td> 1 microlitre </td></tr><tr><td> Oligo (dT) (0,5 pg / pl) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> L'eau traitée au DEPC </td><td> (8-x) ul </td></tr><tr><td> Volume total: </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Remarque: x est le volume de l'ARN utilisé pour la synthèse de l'ADNc. Selon la concentration de l'ARN, 2-3 ug d'ARN sera utilisé pour chaque réaction et le volume total de chaque réaction devrait être de 10 pi. </td></tr></tbody></table></li><li> Placer le mélange réactionnel ci-dessus dans un thermocycleur à 65 ° C pendant 4 minutes. </li><li> Retirer les tubes de la theromocyler et les placer sur la glace immédiatement pendant au moins 2 minutes. </li><li> Préparer le premier brin master mix en ajoutant les éléments suivants: <table border="0"><tbody><tr><td> 10X tampon RT </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mM MgCl 2 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> DTT 0,1 M </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> RNase hors </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table></li><li> Ajouter 9 ul de mélange maître à chaque tube contenant l'échantillon d'ARN, mélanger en pipetage et centrifuger brièvement le mélange. </li><li> Placer les tubes de retour dans le thermocycleur et incuber pendant 2 minutes à 42 ° C. </li><li> Pause le thermocycleur et ajouter 1 l de Superscript II transcriptase inverse (Invitrogen) à chaque tube. Cette étape doit être fait rapidement. </li><li> Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 1,5 heures. </li><li> Terminer la réaction à 70 ° C pendant 15 minutes. </li><li> Retirer les tubes du thermocycleur et les placer sur la glace. </li><li> Ajouter 1 pl de RNase H pour chaque tube et les replacer dans le thermocycleur à 37 ° C pendant 20 minutes. </li><li> Après le prélèvement des échantillons de la thermocycleur, ajouter 20 ul d'eau sans nucléase dans chaque tube. Le volume de chaque échantillon est doublé à ce stade. </li><li> Vérifiez la concentration de chaque échantillon en utilisant 2 pl de l'échantillon. Prenez aliquote de chaque échantillon, pour faire de la concentration de 20ng/μl pour une utilisation dans qRT-PCR. La quantité d'eau pour compenser les échantillons à une concentration de 20ng/μl dépendra de la concentration initiale de l'ADNc synthétisé. </li></ol> IV. qRT-PCR: Conception d'amorce et détermination du gène de référence <ol><li> Amorces Design avec une température de fusion (Tm) de 60 ° C et une taille de produit de ~ 100 pb. </li><li> AP-PERI1 est utilisé comme le gène d'intérêt pour cette expérience. Un gène de référence ou de contrôle interne est nécessaire pour une analyse ultérieure et la normalisation des données. Protéine ribosomique (AP-RP1) est utilisé comme gène de référence pour cette expérience. </li><li> Préparer 5um stocks d'exploitation des amorces qui seront utilisées, y compris votre gène de référence. </li></ol> Préparation des normes <ol start="4"><li> Afin de calculer l'efficacité des amorces utilisées normes doit être faite. </li><li> Faites un mélange de l'ADNc à partir des différents échantillons qui seront testés. </li><li> Faire des dilutions en série 5X pour chaque point désiré dans le graphique. Quatre dilutions devrait être suffisant, mais cinq sont fortement recommandés. </li><li> Le volume varie en fonction du nombre de points et combien reproduit techniques sont utilisées. Il devrait être assez pour faire une norme pour chaque gène testé, y compris le gène de référence. </li></ol> Modèle plaque <ol start="8"><li> Conception d'un modèle indiquant le nom de l'échantillon pour chaque puits de la plaque qRT-PCR. N'oubliez pas d'inclure des normes pour chaque gène et au moins deux techniques répétitions par échantillon. </li></ol> Définissez les paramètres du vélo <ol start="9"><li> Mettez la machine qRT-PCR et entrer les paramètres du vélo. Les paramètres du vélo pour cette expérience est la suivante: Etape 1: <ul><li> 1 cycle: 95 ° C 3 min </li></ul> Étape 2: <ul><li> 40 cycles: 95 ° C 15 sec suivie par 60 ° C 30 sec (Facultatif: pour déterminer la courbe de fusion comprennent les étapes suivantes) </li></ul>Étape 3: <ul><li> 1 cycle: 95 ° C 1 min </li></ul> Étape 4: <ul><li> 1cycle: 55 ° C 1 min </li></ul> Étape 5: <ul><li> 81 cycles: 55 ° C 30 sec </li></ul></li></ol> Plaque mis en place pour CFX96 (BioRad) machine <ol start="11"><li> Préparer le mélange maître pour chaque gène (y compris le gène de référence) dans un tube séparé. Pour chaque puits, le master mix se compose de <table border="0"><tbody><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2,5 X SYBR green </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Amorce sens </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Inverse Primer </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 8 pl </td></tr></tbody></table></li><li> Pendant la préparation du mélange maître comprennent 1-2 réactions supplémentaires pour tenir compte des erreurs de pipetage. </li><li> Selon le modèle déjà conçu, ajouter 2 uL (20 ng / uL) de l'ADNc dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 8 uL du mélange maître à chaque puits, résultant en un volume total de 10 ul par réaction. </li><li> Pipeter haut et en bas (2-3X) pour s'assurer que l'échantillon soit bien mélangé. Vérifiez qu'aucun liquide ne reste sur la pointe. Pour éviter la contamination croisée, utiliser un nouvel embout pour chaque échantillon. </li><li> Une fois la plaque entière est en place, recouvrir la plaque avec du ruban optique. Évitez de toucher la bande comme la présence de graisse peut affecter la lecture. Puis, centrifuger la plaque à 500 rpm pendant 1 minute pour s'assurer que tous les produits dans les puits sont au bas de la plaque. </li><li> Après la centrifugation, vérifier qu'il n'ya pas de glace ou d'eau sur le fond de la plaque. Enfin, placer la plaque dans la machine qRT-PCR et exécuter le programme de PCR. </li></ol> V. représentation schématique de l'Expérience <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Diagramme illustrant l'ordre séquentiel des étapes pour l'étude de l'expression génique. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: A) des larves EAB dissection montrant l'intestin moyen dans le milieu. B) l'intestin moyen des larves de l'agrile du frêne isolées <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: A) Les valeurs moyennes d'expression relative (REV) pour un gène peritrophin (AP-PERI1) dans différents tissus larvaires dont la cuticule (Cu), l'intestin moyen (MG) ​​et corps gras (FB). Une EAB protéine spécifique du ribosome (ci-après nommées, AP-RP1) a été utilisé comme contrôle interne pour normaliser les données obtenues pour le gène d'intérêt, l'AP-PERI1. B) Variation relative pli de l'AP-PERI1 dans les tissus des larves. Le tissu cuticules montré la moindre expression, et donc a été prise comme calibrateur (1X) échantillon (Pfaffl, 2001). <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: A) Les valeurs moyennes d'expression relative (REV) pour un gène peritrophin (AP-PERI1) dans les différents stades de développement de l'agrile du frêne, y compris stades larvaires (1er, 2e, 3e et 4e), prénymphes (PP) et adultes (A). Une EAB protéine spécifique du ribosome (AP-RP1) a été utilisé comme contrôle interne pour normaliser les données obtenues pour le gène d'intérêt, l'AP-PERI1. B) Variation relative pli de l'AP-PERI1 dans divers stades de développement. L'échantillon PP a montré le niveau le moins du taux d'ARNm et donc a été prise comme calibrateur (1X échantillon). VI. Conclusion Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) est un outil efficace pour diagnostiquer les niveaux d'ARNm dans les tissus des insectes et des stades de développement. En outre, qRT-PCR a surtout été le principal outil pour valider les données générées à partir des analyses d'expression génique à haut débit comme les puces et la nouvelle génération de l'ARN-Seq.

<ol><li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritrophic+matrix+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li>
<li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly%2C+Mayetiola+destructor+%5BSay%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Arc+of+Insect+Bio%22%5BJournal%5D)">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li>
<li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li>
<li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li>
<li>Tellam, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTellam%2C+RL+%22Biology+of+the+Insect+Midgut%22">Biology of the Insect Midgut</a>. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).</li>
</ol>

Les cycles de seuil (Ct) valeur est obtenue pour chaque échantillon dans la plaque qRT-PCR. Pour faire la courbe standard, la valeur de Ct obtenues pour chaque dilution a été comploté contre le journal de sa concentration. Les valeurs de Ct pour les échantillons expérimentaux ont ensuite été reportées sur cette courbe standard de dilution en série. Quantités cibles ont été calculés à partir de différentes courbes standard généré pour chaque tissu soit expérimentation et d&#39;expression du développement. Les valeurs d&#...

analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( agrilus planipennis) en utilisant quantitative en temps réel-pcr

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

L&#39;agrile du frêne (AF,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;) Est un ravageur exotique envahissante, qui a tué des millions de frênes (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp) en Amérique du Nord.<strong&gt;</strong&gt; L&#39;agrile du frêne continue à se propager rapidement et les attaques des cendres des arbres d&#39;âges différents, de jeunes arbres à des arbres matures. Toutefois, à ce jour très peu ou pas de connaissances moléculaires existe pour l&#39;agrile du frêne. Nous sommes intéressés à déchiffrer les mécanismes moléculaires à base physiologique au niveau des tissus que l&#39;agrile du frêne aide à la colonisation réussie de frênes. Dans ce rapport, nous montrons l&#39;utilisation efficace de méthodes quantitatives en temps réel de PCR (qRT-PCR) pour déterminer les niveaux d&#39;ARNm dans différents tissus larvaires (y compris l&#39;intestin moyen, gras corps et cuticule) et les différents stades de développement (dont 1<sup&gt; Er</sup&gt; -, 2<sup&gt; Nd</sup&gt; -, 3<sup&gt; Rd</sup&gt; -, 4<sup&gt; E</sup&gt;-Stades, prénymphes et adultes) de l&#39;agrile du frêne. À titre d&#39;exemple, un gène peritrophin (ci-après nommée,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;) Est illustré comme le gène d&#39;intérêt et une protéine ribosomique (<em&gt; AP-RP1</em&gt;) Que le contrôle interne. Peritrophins sont des composantes importantes de la membrane péritrophique / matrice (PM), qui est la doublure de l&#39;intestin de l&#39;insecte. Le PM a différentes fonctions, dont la digestion et la protection mécanique de la épithélium de l&#39;intestin.

Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) est un outil efficace pour diagnostiquer les niveaux d&#39;ARNm dans les tissus des insectes et des stades de développement. Dans ce rapport, nous montrons l&#39;utilisation de qRT-PCR pour déterminer les niveaux d&#39;ARNm dans différents tissus des larves et les stades de développement de l&#39;espèce d&#39;insecte invasif, l&#39;agrile du frêne.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

L'agrile du frêne (EAB, Agrilus planipennis) est un ravageur envahissant exotique qui a tué des millions de frênes (Fraxinus spp) en Amérique du Nord. L'EAB...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser l'expression génique dans les tissus et les stades de développement du Boer du frêne émeraude à l'aide de la PCR quantitative. Cela est réalisé par la dissection des tissus larvaires et la catégorisation des stades de développement. Dans un deuxième temps, extraire l'ARN à partir des tissus et des stades de développement à l'aide du réactif triol, qui est ensuite utilisé comme matrice pour générer le brin complémentaire d'ADN, l'ADNc, suivie de la synthèse du brin complémentaire d'ADNc ; la qRT-PCR est ensuite effectuée.Des résultats sont obtenus qui montrent une expression différentielle du gène cible dans divers tissus larvaires et stades de développement, en se basant sur les données complètes de variation obtenues à partir des valeurs de seuil de cycle après amplifications R-T-P-C-R quantitatives. Bonjour, je suis Prakash Mi, le chercheur principal de ce laboratoire au Département d'entomologie de l'Université d'État de l'Ohio.Notre laboratoire étudie principalement les aspects génomiques ou moléculaires des interactions entre l'émale, le larve, le bupreste et le frêne. L'émale, le larve, le bupreste ou EAB (Agrilus planipennis) est un ravageur exotique envahissant originaire de Chine qui menace l'existence même des populations de frênes en Amérique du Nord. Aujourd'hui, nous allons vous présenter un protocole d'analyse de l'expression génique dans l'EAB en utilisant la PCRq ou PCR quantitative en temps réel.Et les membres du laboratoire qui participeront à ce protocole sont Swapna Priou, qui effectuera les dissections des valves, puis Bin Bandari, qui montrera l'isolement de l'ARN. Enfin, Lauren Rivera Vega s'occupera de l'analyse de QPC. Nous utilisons également cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'expression génique de l'ash.Commençons donc. Avant le début de cette procédure, placez les larves d’agrile du frêne émeraude B ou EAD sur du papier absorbant humide. Conservez au froid, sur de la glace, du chlorure de sodium tamponné au phosphate fraîchement préparé à 1 x, ou PBS, jusqu’à ce que les dissections soient réalisées, afin de maintenir le tampon froid pendant toute la durée de la dissection.Pour commencer, fixez les larves de DED sur la plaque de dissection à l'aide d'épingles de dissection fines. Ajoutez ensuite du PBS 1X froid sur la plaque de dissection. Découpez d'abord la tête des larves à l'aide d'une paire de ciseaux de dissection fine.Ensuite, retirez le dernier segment abdominal des larves à l’aide d’une pince de bijoutier. Soulevez la cuticule du cadavre larvaire, puis pratiquez une incision le long du cadavre à l’aide d’une paire de ciseaux. Veillez à ne pas rompre l’intestin.Lorsque l'incision est effectuée, isoler soigneusement le tissu du mésentère des autres tissus, tels que les corps gras et le tissu conjonctif. Rincer ensuite le tissu dans 1 ml de tampon PBS 1× frais afin de s'assurer qu'il n'y a aucune contamination par le corps gras. Transférer le mésentère dans 500 microlitres de réactif TRIol prérefroidi dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre.Ensuite, isolez le tissu du corps gras à l’aide de pinces et transférez-le dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de réactif Triol refroidi. Enfin, isolez le tissu de la cuticule à partir du cadavre larvaire en grattant soigneusement tout tissu adhérent, sans nuire à l’intégrité du tissu.Rincez le tissu de cuticule isolé dans du tampon PBS frais et transférez-le dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de réactif de triazole refroidi. Les tissus isolés de corps gras, de cuticule et de tube digestif moyen peuvent être conservés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'extraction de l'ARN. En prévision de l'extraction de l'ARN, triez les différents échantillons de PSB selon les stades de développement.Ces stades comprennent le premier, le deuxième, le troisième et le quatrième stade chez les étoiles, les PrepU et les adultes. Pour commencer l'extraction d'ARN, homogénéisez d'abord les tissus dans le triol contenu dans des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre à l'aide de baguettes en plastique. Après homogénéisation, ajustez le volume total de chaque échantillon à un millilitre avec le réactif triol.Pour les stades de développement, homogénéisez l'animal entier dans de l'azote liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon. Ajoutez ensuite un aliquot de l'homogénat à un millilitre de triol. Incubez les tubes d'échantillons avec un millilitre de triol pendant 15 minutes à température ambiante.Après l'incubation, ajouter immédiatement 200 microlitres de chloroforme à chaque tube après l'ajout de chloroforme. Agiter vigoureusement les tubes pendant environ 15 secondes. Puis incuber les tubes à température ambiante pendant deux à trois minutes supplémentaires.Ensuite, centrifuger les échantillons à 12 000 ×g pendant 15 minutes à deux degrés Celsius. Après la centrifugation, l'ARN se trouvera dans la phase aqueuse. Le volume de la phase aqueuse doit être de 600 microlitres ou 60 % du volume total de triol.Retirez soigneusement uniquement la phase aqueuse. La présence de substances sous la phase aqueuse entraînera une contamination de l'ARN extrait. Transférez ensuite la phase aqueuse dans un tube einor de 1,5 millilitre correctement étiqueté.Pour précipiter l'ARN à partir de la phase aqueuse, ajouter 0,5 millilitre d'alcool isopropylique à chaque tube. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l'incubation, centrifuger les tubes à 12 000 G pendant 10 minutes à deux degrés Celsius. Après la centrifugation, éliminer le surnageant des tubes.L'ARN est présent dans le culot de type gélatineux formé au fond du tube. Laver le culot avec de l'éthanol à 75 %, en ajoutant au moins un millilitre d'éthanol à 75 % par millilitre de mélange, en vortexant. Puis centrifuger les tubes à 7 500 ×g pendant cinq minutes à deux degrés Celsius.Jetez le surnageant des tubes. Centrifugez à nouveau les tubes dans la centrifugeuse de table pendant une minute. Éliminez tout excès de surnageant du tube par pipetage soigneux.Laissez le tube ouvert et laissez sécher l'air du culot pendant cinq à dix minutes. Veillez à ne pas trop dessécher le culot, car cela réduirait considérablement sa solubilité après le séchage à l'air. Resuspendez le culot dans du dathyl percarbonate ou de l'eau traitée dep sea.La quantité d'eau utilisée pour resuspendre le culot dépendra de la taille du culot. Utilisez 50 microlitres d'eau de mer traitée sans DNase pour un petit culot ou 100 microlitres pour un gros culot. Laissez le culot se dissoudre complètement dans l'eau de mer traitée sans DNase en déplaçant plusieurs fois la pointe de pipette vers le haut et vers le bas.Une fois que le culot est dissous, placez l'échantillon à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, mesurez la concentration de chaque échantillon d'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop. Enfin, effectuez la synthèse de l'ADN de premier brin pour les échantillons d'ARN respectifs en utilisant le système de synthèse de premier brin SuperScript d'Invitrogen pour la RT-PCR.Cette procédure est décrite dans la partie écrite de ce protocole. Pour commencer la conception de la PCR quantitative en temps réel ou Q-R-T-P-C-R, concevoir chaque amorce afin qu'elle ait une température de fusion de 60 degrés Celsius et une taille de produit d'environ 100 paires de bases. AP par un est utilisé comme gène d'intérêt pour cette expérience.Un gène de référence ou contrôle interne est nécessaire pour l'analyse ultérieure et la normalisation des données. Ici, la protéine ribosomique a P RRP un est utilisée comme gène de référence. Ensuite, concevoir un modèle indiquant le nom de l'échantillon pour chaque puits et la plaque de qPCR.N'oubliez pas d'inclure des standards pour chaque gène et au moins deux réplicats techniques par échantillon. Ensuite, allumez la machine de PCR quantitative en temps réel et saisissez les paramètres de cyclage pour configurer la plaque pour la machine CFX 96. Préparez d'abord le mélange maître pour chaque gène dans un tube séparé pour chaque puits.Le mélange maître est composé de deux microlitres d'eau sans nucléase, de quatre microlitres de cyber vert 2,5 x, d'un microlitre d'amorce avant et d'un microlitre d'amorce arrière, pour un volume total de huit microlitres. Selon le modèle précédemment conçu, ajouter deux microlitres d'ADNc à chaque puits. Ensuite, ajouter huit microlitres du mélange maître dans chaque puits, obtenant ainsi un volume total de 10 microlitres par réaction ; pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de s'assurer que l'échantillon est bien homogénéisé.Vérifiez qu'aucun liquide ne reste sur l'embout. Pour éviter toute contamination croisée, utilisez un nouvel embout pour chaque échantillon. Une fois la plaque entièrement préparée, recouvrez-la d'un ruban optique.Évitez de toucher le ruban car la présence de graisse peut affecter la lecture. Ensuite, centrifugez la plaque à 500 tr/min pendant une minute afin de s'assurer que tous les produits présents dans les puits se trouvent au fond de la plaque après la centrifugation. Vérifiez qu'il n'y a ni glace ni eau au fond de la plaque.Enfin, placez la plaque dans la machine de PCR en temps réel QR et lancez le programme de PCR représentatif pour les larves de l'agrile du frêtier. La dissection et la PCR en temps réel QR sont illustrées ici. La dissection de la larve de l'agrile du frêtier devrait révéler le tube digestif moyen au centre de la larve.L'intestin moyen de la larve de PSB est isolé comme illustré ici, avec les valeurs moyennes d'expression relative ou VRE. Les valeurs pour le gène de la paratrophine AP par un sont indiquées ici pour différents tissus larvaires, incluant la cuticule, l'intestin moyen et les corps gras. La protéine ribosomique spécifique du PSB ARP un a été utilisée comme témoin interne pour normaliser les données obtenues pour le gène d'intérêt.Le changement relatif du nombre de copies de AP AP par un a été extrait pour les différents tissus larvaires. Le tissu de cuticule a montré la plus faible expression et a donc été pris comme échantillon témoin pour les moyennes RV de AP Perry. Un dans différents stades de développement du PSF, incluant les premiers, deuxièmes, troisièmes et quatrièmes stades larvaires.Les échantillons de PrepU et d'adultes ont été déterminés en utilisant aprp one comme témoin interne pour normaliser les données. Le changement relatif du nombre de copies d'AP Perry one a été déterminé pour différents stades de développement. Ici, l'échantillon PrepU a montré le niveau d'ARNm le plus faible et a donc été utilisé comme échantillon calibrateur.Nous venons de vous montrer comment réaliser des dissections latérales et, par la suite, une analyse d'expression génique à partir des régions latérales, ainsi que de divers stades de développement d'Emeral ra, en utilisant la RT-q-PCR. Vous devez faire attention lors de la dissection afin d'éviter toute contamination croisée des échantillons de tissus. De plus, il est essentiel de manipuler avec précaution lors de la réalisation de la RT-q-PCR afin de pipeter chaque échantillon dans le puits PCR correspondant.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé notre vidéo et bonne chance avec vos expériences.

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