L'étiquetage et l'imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer des cellules neuronales avec une résolution élevée dans l'embryon de poisson zèbre. Tout d'abord, de l'ADN codant pour une protéine fluorescente verte ciblant la membrane est injecté dans un embryon de poisson zèbre au stade une cellule, ce qui entraîne une transmission en mosaique, permettant ainsi une meilleure observation de cellules isolées. Les embryons sont ensuite marqués par immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-GFP et sectionnés, ce qui permet de visualiser la morphologie de cellules individuelles avec une résolution élevée sur des préparations fixées. Alternativement, des embryons vivants peuvent être analysés à l'aide de la microscopie vidéo en laps de temps afin d'observer la dynamique cellulaire.

Des résultats sont obtenus montrant la morphologie ou la dynamique cellulaire. Ici, le cerveau postérieur du poisson zèbre est imagé par microscopie confocale. Bonjour à tous.

Je suis PR Chandran du laboratoire de la Dre Rachel Brewster au département des sciences biologiques de l'Université du Maryland à Baltimore County. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de marquer et d'imaginer des cellules neuronales dans un embryon de poisson zèbre avec une résolution plus élevée. Nous utilisons généralement cette procédure en laboratoire pour étudier les mécanismes de la neurogenèse chez l'embryon de poisson zèbre au niveau cellulaire.

Commençons. Placez des lingettes humides Kim autour du bord d'une boîte de Pétri de 100 millimètres.

Fixez soigneusement une micro-épingle en verre sur une bande de cire à l'intérieur de la boîte humidifiée. Sous un microscope stéréoscopique de dissection, alignez l'aiguille par rapport à une lame graduée. Pour obtenir une pointe de taille appropriée, utilisez une lame de rasoir propre pour taper délicatement sur l'aiguille à l'endroit où son diamètre mesure un micromètre.

Connectez l'aiguille à la pipette de l'appareil de microinjection, déposez 0,5 microlitre d'une solution de rouge de phénol et d'eau sur du film parafilm, puis remplissez l'aiguille par l'avant à partir des gouttelettes. Réglez la pression de microinjection à sept kilopascals et commencez par une impulsion de 20 millisecondes. Comptez le nombre d'impulsions nécessaires pour distribuer tout le liquide. Faites varier la durée entre 10 et 30 millisecondes afin qu'environ 250 impulsions soient nécessaires pour la distribution.

0,5 microlitre de solution. Utilisez une micropipette pour remplir la pipette par capillarité avec 0,5 à un microlitre de MG FPD NA dans l'eau, mélangé avec du rouge de phénol pour la visualisation. Couvrez la boîte humidifiée afin d'éviter l'évaporation de la solution hors de la pipette sous le microscope stéréo.

Placer des embryons de poisson à un stade cellulaire séparé dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie de milieu pour embryon. Utiliser des pinces fines pour saisir délicatement la chorion et stabiliser l'embryon. Déplacer l'aiguille remplie de MGFP et de rouge de phénol vers la zone cible pour l'injection.

Pour une expression étendue de la MGFP, injecter dans le vitellus ou le cytoplasme. Utiliser l'appareil de microinjection pour délivrer environ deux nanolitres de la solution de MGFP. Observer la position de l'indicateur rouge de phénol pour confirmer une injection correcte.

Retirer soigneusement l'aiguille de l'embryon. Injecter tous les embryons dans la boîte, jusqu'à 30 embryons à la fois. Éviter d'exposer les embryons à la lumière et incuber à 28,5 degrés Celsius pour permettre aux embryons de se développer jusqu'au stade souhaité sous le microscope stéréo.

Utilisez une pince fine pour détacher délicatement le corion des embryons. Utilisez une pipette à pâtes pour retirer le corion vide de la boîte, ne laissant que les embryons désenveloppés. Utilisez une pipette à pâtes flambée pour transférer les embryons injectés désenveloppés dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Retirer autant de milieu excédentaire que possible, puis ajouter un millilitre d'ative. Laver les embryons trois fois dans du un XPBS à température ambiante pendant cinq minutes chacun. Transférer les embryons dans une boîte de Pétri remplie de un XPBS sous le microscope stéréo.

Utilisez une pince fine pour maintenir l'embryon près de la région de la queue. Utilisez une deuxième paire de pinces ou un stylet pour essayer d'éliminer autant de yo que possible sans toucher la région du cadre postérieur. En observant au microscope stéréo, utilisez la pince fine pour soulever l'embryon de la boîte et le placer dans un moule à inclusion rempli d'agarose à 4 % à bas point de fusion.

Positionnez l'embryon vers une extrémité du moule. Laissez le bloc d'aros durcir à température ambiante. Utilisez une spatule pour retirer le bloc durci d'aros du moule, en soulevant la lame pour couper uniformément l'extrémité inférieure du bloc.

Utilisez une goutte de colle super glue pour fixer le bloc sur la platine vibratoire, côté découpé vers le bas, si désiré. Alignez plusieurs blocs sur la platine. Fixez la platine à la vibrato.

Veillez à ce que la lame tranche complètement chaque embryon sans aller jusqu’au fond du bloc. Remplissez le plateau avec une section de XPBS. Coupez soigneusement les embryons jusqu’au fond d’un bloc d’agarose et transférez-les dans une boîte de Pétri remplie de XPBS.

Séparez les sections sous le microscope stéréo. Utilisez une pince fine pour placer les sections souhaitées dans une plaque multipuits remplie de XPBS. Utilisez un puits différent pour chaque embryon.

Colorer les coupes avec le DPI et effectuer le marquage immunologique avec l'anticorps anti-GFP. Dans le cas contraire, procéder à l'imagerie dans les 48 heures. Monter jusqu'à six coupes par lame et poser une lamelle au-dessus des coupes pour l'imagerie confocale.

Conservez les lames à l'abri de la lumière pour éviter le photoblanchiment. Pour l'imagerie en direct, les embryons injectés avec MGFP doivent être protégés de la lumière. Utilisez une pince pour enrober les embryons 30 minutes avant qu'ils n'atteignent le stade de développement souhaité.

Transférez les embryons enrobés dans une solution sédative composée de milieu pour embryons contenant 0,01 % de Trica, puis incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Déposez une goutte de 1 % d'agarose ordinaire dans de l'eau sur une boîte de culture de 35 millimètres à fond en verre, de manière à remplir le moule. Laissez l'agarose durcir.

Utilisez le tube capillaire en verre de 90 millimètres pour faire trois trous dans la goutte d'aros sous le microscope stéréo. Examinez le fond du puits et retirez tout résidu d'aros avec des pinces. Remplissez la boîte avec du milieu pour embryons sous le microscope stéréo.

Utilisez une pipette à pâte pour transférer un embryon dans chaque alvéole des aros. Utilisez des pinces fines pour orienter l'embryon de manière à ce que la région d'intérêt, dans ce cas la tête dorsale, repose contre le verre. Couvrez la boîte.

Transportez soigneusement la boîte vers la platine d'un microscope confocal. Utilisez des chauffages d'appoint pour maintenir les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant toute la durée de l'acquisition d'images. Voici une coupe du cerveau postérieur d'un embryon de type sauvage à quatre à cinq somites, doublement marqué avec la GFP ciblée vers la membrane en vert et D en bleu ; un seul cellule est marquée avec la GFP liée à la membrane, permettant une imagerie à haute résolution de la morphologie et de l'organisation cellulaires.

Il s'agit d'une image comparable du cerveau postérieur d'un mutant nardi din au stade de quatre à cinq somites. Cette image révèle que les cellules chez les mutants nardi ne s'orientent pas correctement vers la ligne médiane pendant la neurulation. Contrairement à la méthode de marquage cellulaire par MGFP, l'étiquetage du cerveau postérieur à l'aide d'un marqueur général de la membrane cellulaire tel que la bêta-caténine ne permet pas de visualiser la morphologie des cellules individuelles.

L'imagerie en temps réel du cerveau postérieur d'un embryon marqué avec MG FP révèle que les comportements cellulaires responsables de la neurogenèse chez le poisson zèbre sont très dynamiques et impliquent l'extension de protrusions membranaires au cours de la migration et de l'intercalation des cellules. Nous venons de vous montrer comment préparer des embryons de poisson zèbre fixes et vivants pour une imagerie à haute résolution au niveau cellulaire. C'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.