L'étiquetage et l'imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

L’objectif global de l’expérience suivante est d’imager les cellules neurales à haute résolution Dans l’embryon de poisson zèbre d’abord, une protéine fluorescente verte ciblée par membrane codant pour l’ADN est injectée dans un embryon de poisson zèbre à un stade cellulaire, ce qui entraîne une hérédité en mosaïque, permettant ainsi une imagerie améliorée des cellules dispersées. Les embryons sont ensuite immunomarqués avec un anti GFP et sectionnés, ce qui permet de visualiser la morphologie des cellules uniques à haute résolution dans une préparation fixe. Alternativement, les embryons vivants peuvent être examinés à l’aide de la microscopie vidéo time-lapse afin d’imager la dynamique cellulaire.

On obtient des résultats qui montrent la morphologie ou la dynamique cellulaire. Ici, le cerveau postérieur du poisson-zèbre est imagé par microscopie confocale. Bonjour à tous.

Je suis PR Chandran du laboratoire du Dr Rachel Brewster au département des sciences biologiques de l’Université du Maryland dans le comté de Baltimore. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour marquer et imager les cellules neurales de l’embryon de poisson-zèbre à une résolution plus élevée. Nous utilisons généralement cette procédure en laboratoire pour étudier les mécanismes de relation neurologique dans l’embryon de poisson zèbre au niveau cellulaire.

Alors commençons. Endroit humide. Kim essuie le bord d’une boîte de Pétri de 100 millimètres.

Fixez soigneusement une aiguille de micro-injection en verre sur une bande de cire à l’intérieur du plat humidifié. À l’aide d’un stéréomicroscope à dissection, alignez l’aiguille contre une lame graduée. Pour obtenir une pointe de la bonne taille, utilisez une lame de rasoir propre pour tapoter doucement l’aiguille là où elle a un diamètre d’un micromètre.

Connectez l’aiguille à l’appareil de micro-injection, pipetez 0,5 microlitre d’une solution de rouge de phénol et d’eau sur un film para et remplissez l’aiguille à partir des gouttelettes. Réglez la pression de micro-injection à sept kilo pascals et commencez par une impulsion de 20 millisecondes : comptez le nombre d’impulsions nécessaires pour distribuer tout le liquide. Variez le temps entre 10 et 30 millisecondes de sorte qu’il faille environ 250 impulsions pour la distribution.

0,5 microlitres de solution. À l’aide d’une micropipette, remplissez l’aiguille avec 0,5 à un microlitre de MG FPD NA dans de l’eau, mélangé à du rouge de phénol pour la visualisation. Couvrez la parabole humidifiée pour éviter l’évaporation de la solution hors de l’aiguille sous le stéréomicroscope.

Placez un stade cellulaire séparer les embryons de poisson dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie d’embryons. Douleur moyenne. À l’aide de pinces fines, saisissez doucement le Corian et stabilisez l’embryon. Déplacez l’aiguille remplie de MGFP et de rouge de phénol dans la zone cible pour l’injection.

Pour une large gamme d’expression de MGFP, injecter dans le jaune ou le cytoplasme. À l’aide de l’appareil de microinjection, l’administration d’environ deux nanolitres de la solution MGFP. Observez l’emplacement de l’indicateur rouge de phénol pour confirmer la bonne injection.

Retirez délicatement l’aiguille de l’embryon. Injectez tous les embryons dans la boîte jusqu’à 30 embryons à la fois. Évitez d’exposer les embryons à la lumière, incubez à 28,5 degrés Celsius pour permettre aux embryons de se développer jusqu’au stade souhaité sous le stéréomicroscope.

À l’aide d’une pince fine, décollez délicatement le Corian des embryons. À l’aide d’une pipette à pâtes, retirez le corian vide du plat, en ne laissant que les embryons enrobés. À l’aide d’une pipette à pâtes polie au feu, transférez les embryons enrobés injectés dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Retirez autant de fluide supplémentaire que possible, puis ajoutez un millilitre d’atif. Lavez les embryons à température ambiante une fois XPB S3 pendant cinq minutes chacune. Déplacez les embryons dans une boîte de Pétri remplie d’un XPBS sous le stéréomicroscope.

À l’aide d’une pince fine, tenez l’embryon près de la région de la queue. Utilisez une deuxième paire de pinces ou un tisonnier pour essayer d’enlever autant de yo que possible sans toucher la région du cadre arrière. En regardant au microscope stéréoscopique, utilisez la pince fine pour soulever l’embryon de la boîte et le placer dans un moule de sectionnement rempli de 4 % de point de fusion bas. Aros.

Positionnez l’embryon vers une extrémité du moule. Laissez les aros se solidifier à température ambiante. À l’aide d’une spatule, retirez le bloc d’aros durci du moule à l’aide d’une lame levée, coupez uniformément l’extrémité inférieure du bloc.

Utilisez une goutte de super colle pour ancrer le bloc à l’étage de vibrato, coupé côté vers le bas si vous le souhaitez. Alignez plusieurs blocs sur la scène. Fixez la platine au vibrato.

Assurez-vous que la lame tranchera tout le long de chaque embryon, mais pas complètement à travers le bloc. Remplissez la scène avec une section XPBS. Les embryons sont soigneusement coupés à l’arrière d’un bloc d’arou et transférés dans une boîte de Pétri remplie d’un XPBS.

Séparez les coupes sous le stéréomicroscope. À l’aide d’une pince fine, placez les sections souhaitées dans un plat multipuits rempli d’un XPBS. Utilisez un puits différent pour chaque embryon.

Colorer les sections avec DPI et immuno marquer avec anti GFP. Sinon, imagerie dans les 48 heures. Montez jusqu’à six sections par lame et placez une lamelle de recouvrement sur les sections pour l’imagerie confocale.

Stockez les diapositives dans l’obscurité pour éviter le blanchiment des photos. L’imagerie en direct, le MGFP injecté les embryons doit être protégé de la lumière. Utilisez des forceps pour enrober les embryons 30 minutes avant qu’ils n’atteignent le stade de développement souhaité.

Transférez les embryons enrobés dans une solution sédative de milieu embryonnaire avec 0,01 % Trica incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Une goutte de pipette de 1 % régulière est apparue dans l’eau sur une boîte de culture à fond en verre de 35 millimètres afin qu’elle remplisse le moule. Laissez les agros se solidifier.

À l’aide du tube capillaire en verre de 90 millimètres, faites trois trous dans la goutte d’aros sous le stéréomicroscope. Examinez le fond du puits et retirez tout résidu à l’aide d’une pince. Remplissez la boîte de milieu embryonnaire sous le stéréomicroscope.

À l’aide d’une pipette à pâtes, transférez un embryon dans chaque trou de l’aros. Utilisez des pinces fines pour orienter l’embryon de manière à ce que la zone d’intérêt, dans ce cas, la tête dorsale, repose contre le verre. Couvrez le plat.

Transportez avec précaution la parabole jusqu’à la platine d’un microscope confocal. Utilisez des radiateurs pour maintenir les embryons à 28,5 degrés Celsius tout au long de l’imagerie. Voici une coupe à travers le cerveau postérieur d’un embryon de type sauvage à quatre à cinq somites doublement marqués avec une GFP ciblée sur membrane en vert et D en bleu, une seule cellule est marquée avec une GFP liée à la membrane, permettant une imagerie à haute résolution de la morphologie et de l’organisation cellulaires.

Il s’agit d’une image comparable du cerveau postérieur d’un mutant nardi din à cinq somites. Cette image révèle que les cellules de nardi et des mutants ne parviennent pas à s’orienter correctement vers la ligne médiane lors de la révélation neurologique. Contrairement à la méthode de marquage des cellules avec du MGFP, le marquage du cerveau postérieur avec un marqueur général de surface cellulaire tel que la bêta-caténine ne permet pas de visualiser la morphologie des cellules individuelles.

L’imagerie en accéléré du cerveau postérieur d’un embryon marqué MG FP révèle que les comportements cellulaires qui régissent la relation neurologique chez le poisson zèbre sont très dynamiques et impliquent l’extension des protubérances membranaires lorsque les cellules migrent et s’entre-assemblent. Nous venons de vous montrer comment préparer des embryons de poissons-zèbres fixes et vivants pour l’imagerie unicellulaire à haute résolution. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.