Flash de congélation et Cryosectioning E12.5 cerveau de souris

Bonjour, je suis Spencer Curley de l’Université de Californie à Irvine et du laboratoire d’Ed Maki, et je vais vous montrer comment faire de la cryosection. Pour ce faire, j’utilise d’abord ces réactifs couramment utilisés. Le composé d’enrobage ou le média d’enrobage que j’utilise s’appelle OCT pour une température de coupe optimale.

C’est une solution claire, elle est très épaisse et visqueuse, et elle maintient bien le tissu pendant que vous pouvez l’orienter, puis elle gèle, et finalement elle est soluble dans l’eau, ce qui vous permet de vous en débarrasser lors de tout type de procédure de coloration. J’ai donc intégré le tissu dans un moule. Ces conteneurs de biopsie cryo-moulés, ils sont de différentes tailles.

Je vais utiliser ce moule plus petit ici parce que je fais du tissu embryonnaire de souris. Nous congelons nos tissus et l’azote liquide. Je vais donc d’abord remplir cette bouteille de protection avec de l’azote liquide provenant de notre réservoir ici.

Avant de congeler les tissus, vous devez ce qu’on appelle cryoprotéger les tissus, sinon la congélation elle-même détruira les tissus. Donc, ce que vous faites, c’est que vous plongez le tissu dans une solution à 30 % de saccharose pendant la nuit. Et si cela prend plus de temps, ce n’est pas grave, tant que le tissu coule.

Et comme vous pouvez le voir, les têtes de souris embryonnaires du jour 12,5 sont, ont coulé dans la, dans la solution de saccharose, de sorte qu’elles sont prêtes à être congelées. Alors maintenant, je vais simplement verser le tissu qui se trouve dans une solution de saccharose dans un plat plus grand que moi, afin de pouvoir manipuler le tissu. Je vais prendre une partie de cet OCT et le verser dans ce plat de 35 millimètres qui repose en fait sur son couvercle pour que je puisse le prendre en biais.

Ainsi, l’OCT s’accumule le long du bord pour plus de profondeur. J’utilise donc une paire de pinces émoussées plus anciennes simplement parce que vous n’avez pas besoin qu’elles soient tranchantes et que vous ne voulez pas ruiner une autre paire de pinces. Alors moi, je les prends et je sors une de ces têtes très doucement, et je la place dans ce premier bain d’OCT.

Je veux juste enrober l’embryon d’OCT. Cela permet, pour une meilleure congélation plus uniforme des tissus. Vous ne voulez pas de saccharose résiduel autour des tissus ou de bulles d’air.

Évitez certainement les bulles d’air. Donc, je remue doucement l’OCT autour et sous la tête, je déplace le, je déplace la tête à travers l’OCT et je la laisse reposer là pendant quelques secondes pendant que je remplis mon moule cryo. Alors maintenant, je vais remplir le moule cryo avec le, l’OCT, encore une fois, en évitant les bulles.

Et je vais juste le remplir jusqu’au, jusqu’au sommet du moule. Et comme vous le remarquerez, j’ai étiqueté le, le moule. Alors je vais, je pourrai voir mon orientation une fois qu’elle sera gelée.

Lorsque l’OCT gèle, il devient blanc et vous ne pouvez plus voir vos tissus. Vous voulez donc absolument étiqueter un marqueur permanent. Le, le moule cryo.

En fait, j’ai eu une bulle dans l’OCT, alors je vais utiliser mes forceps pour la pousser par-dessus le bord. Vous ne voulez pas que cela interfère avec votre, avec la congélation de vos tissus. Alors maintenant, je vais transférer la tête de ce plat dans l’OCT qui est dans mon moule.

Je vais juste le sortir du plat et le placer dans le moule très doucement. Ensuite, je vais passer au microscope où je vais orienter le tissu. J’ai le tissu dans mon moule cryogénique ici, et je vais regarder à travers la lunette pour pouvoir l’orienter.

Je vais faire des coupes coronales à travers cette tête de souris. J’ai donc besoin de l’orienter de manière à pouvoir le positionner dans le cryostat pour les coupes coronales. Encore une fois, j’utilise ces vieilles pinces émoussées et, comme vous pouvez le voir, il y a des bulles ici et je vais faire de mon mieux pour les faire sortir.

Mais ces bulles plus petites ne sont pas, ne sont pas mauvaises. Je n’ai rien remarqué avec ces petites bulles. Vous ne voulez tout simplement pas de grosses bulles.

Je vais donc les sortir du mieux que je peux et essuyer souvent les forceps, car vous pouvez mieux éviter les bulles de cette façon. Et maintenant, si vous pouvez voir mon étiquetage, j’ai un t ici en haut et un F à ma gauche ici. Cela m’indique simplement que la tête, le haut de la tête va être vers le haut et que l’avant ou le visage va être à ma gauche.

De cette façon, je sais quelle surface sectionner pour les coupes coronaires et je ne fais que pousser le tissu. Et encore une fois, cela introduit parfois des bulles et vous voulez simplement les pousser vers l’extérieur pour qu’elles ne gèlent pas avec le tissu. Il est donc mauvais d’avoir des bulles, principalement parce que lorsque vous gelez, les bulles tissulaires peuvent provoquer une congélation incohérente.

Le but de la congélation instantanée est de tout figer en même temps. De plus, lorsque vous coupez à travers le tissu et le cryostat, si la lame passe à travers une bulle plutôt que l’OCT ou le tissu, cela peut provoquer un accroc ou une déchirure et, et détruire ou, vous savez, briser votre tissu. Vous voulez donc absolument éviter ces bulles à tout prix.

Les plus grands surtout. Je suis donc toujours en train de l’orienter ici. Ce tissu a été fixé pendant 24 heures, il est donc assez solide pour mes manipulations.

D’autres tissus peuvent être un peu plus doux, vous voulez donc simplement être très doux. Donc, une fois que je l’ai positionné sous la lunette avec le visage vers la gauche et le haut de la tête vers le haut, je vais devoir m’assurer qu’il est correct dans d’autres plans d’orientation également. Je vais donc soulever et regarder à travers toutes les faces du cube pour m’assurer qu’il est correct.

Et je vois qu’il est légèrement incliné vers le bas, donc je dois simplement le soulever avec mes pinces. D’accord? Et cela demande certainement beaucoup de pratique. D’accord, ça a l’air bien.

Maintenant, je vais marcher ici et le congeler dans de l’azote liquide. D’accord, maintenant que le tissu est correctement orienté dans le moule cryogénique, je vais verser mon azote liquide dans ce plat ici. Il s’agit simplement d’une boîte de Pétri en plastique normale pour la culture tissulaire jusqu’au sommet.

Il s’évapore assez rapidement. Je vais prendre mes pinces et abaisser le moule cryogénique. Et comme vous pouvez le voir, j’ai en fait plié la lèvre inférieure.

Cela permet certainement une meilleure manipulation. Je vais le congeler. Et lorsque le tissu et l’OCT gèlent, ils deviennent d’un blanc solide.

Et une fois que c’est terminé, tout sera blanc. Et puis je dois rapidement placer le tissu congelé dans le congélateur de moins 80 pour le stockage. Vous voulez le tenir de manière à ce que le tissu ne soit pas submergé.

Vous devez donc faire très attention à le tenir dans la surface supérieure de l’azote liquide. D’accord, maintenant c’est gelé. Maintenez-le là pendant quelques secondes supplémentaires avant que je ne passe au moins 80.

D’accord, maintenant je vais le prendre jusqu’à moins 80. J’ai donc pris mon tissu à moins 80 et je l’ai placé dans ce cryostat ici. La chambre est en fait à moins 24 degrés Celsius.

À l’heure actuelle, vous devez laisser les tissus s’équilibrer pendant environ une demi-heure à une heure avant de pouvoir commencer la section. Sinon, il est trop cassant. Donc, bien que toutes les statistiques cryos soient différentes, je vais juste souligner certaines des choses de base à propos de cette machine ici.

Nous utilisons donc le Leica CM 30 50 s. C’est une bonne machine car elle dispose d’une unité de refroidissement séparée pour l’échantillon lui-même, ce qui est un avantage supplémentaire appréciable. Vous pouvez régler la température de l’échantillon et, et différents tissus nécessitent des températures différentes pour la coupe.

Ainsi, lorsque vous chargez votre tissu pour la première fois, vous devez faire plusieurs ajustements. Et celles-ci sont similaires sur toutes les statistiques cryos. Il s’agit d’appareils électroniques, dont certains sont actionnés à la main.

Par exemple, vous devrez rétracter le bras du cryostat ou l’avancer pour le positionner plus ou moins près de la lame. Vous pouvez le faire rapidement ou lentement. Vous pouvez régler l’épaisseur de votre coupe avec, avec ce plus ou ce moins ici.

Et vous choisirez entre l’épaisseur de la coupe ou de la section, qui est indiquée dans le bouton du milieu ici. Vous régulerez la température de la chambre ou de l’échantillon lui-même à côté de cet affichage numérique en appuyant simplement dessus et en utilisant ces flèches vers le haut ou vers le bas pour régler la température. Donc, pour nous, lorsque nous faisons de la cryosection, nous utilisons ces Super frosts de la marque Fish Fisher ainsi que des lames de microscope.

Ils sont recouverts d’un adhésif afin que le tissu pendant le traitement ne se détache pas. Parfois, pendant la section, vous remarquerez que le tissu semble un peu mou et certaines indications de cela seront s’il frappe la lame et se regroupe. Et ce que vous pouvez utiliser pour résoudre ce problème, c’est ce gel super convivial de la marque Fisher.

C’est, c’est, il gèle instantanément le tissu et vous n’avez qu’à le viser sur votre tissu et appuyer sur la gâchette et il recongèlera rapidement le tissu s’il est trop mou. Avant de monter le tissu sur un mandrin pour la section, j’aimerais vous faire un tour rapide de certaines des choses dans la machine ici. C’est donc là que vous chargez réellement la lame, qui est fixée avec cette plaque métallique.

En tirant sur ce bras, vous pouvez retirer et remplacer la lame si nécessaire. Assurez-vous qu’il est agréable et sécurisé. Vous ne voulez pas trop sécuriser la lame, sinon elle se déforme.

Et vous remarquerez dans votre sectionnement que l’épaisseur du tissu n’est pas, n’est pas constante. Donc, vous voulez, vous ne voulez pas pousser ce bras jusqu’en bas. Vous voulez simplement l’amener là où il se trouve, même avec la, avec la lame elle-même.

Voici une autre chose que vous devrez peut-être ajuster pendant la section. C’est ce qu’on appelle la plaque anti-roulis. C’est un morceau de verre qui s’insère dans ce support ici et vous pouvez l’ajuster à l’aide de cette vis à ressort ici.

Et en gros, vous le déplacez vers l’avant ou vers l’arrière. Et cela maintiendra vos tissus ou vos sections à plat afin que vous puissiez les monter sur une diapositive. Une autre chose que vous voudrez peut-être ajuster pendant la coupe est l’endroit sur la lame qui effectue la coupe proprement dite.

Alors, comment ajustez-vous cela, c’est-à-dire que vous soulevez simplement ce levier et vous pouvez faire glisser tout cet engin à gauche ou à droite. Et vous ne l’utilisez vraiment que si vous remarquez que vos tissus s’accrochent à une certaine partie de la lame ou si vous voulez économiser des lames parce qu’elles sont plutôt chères. Ainsi, vous pouvez trouver une belle zone propre simplement en le déplaçant d’avant en arrière.

Une autre chose que vous pouvez ajuster est l’angle de coupe. Maintenant, sur le côté ici, que vous ne pourrez pas voir, il y a trois positions différentes. Nous utilisons simplement la position médiane et vous l’ajustez en soulevant cet autre levier.

Et, et cela peut, vous pouvez faire monter et descendre cet engin. Nous le gardons toujours au milieu. Je vais donc m’en tenir à ça maintenant.

Donc, ici, c’est la, la tête du cryostat. Il tiendra en fait l’échantillon de tissu congelé pendant qu’il est sectionné. Il se balance de haut en bas et avance vers la lame.

Et en gros, vous montez le tissu sur ce mandrin ici et nous allons placer le mandrin dans la, dans la tête, le serrer, puis utiliser ces boutons à l’arrière pour ajuster l’angle afin d’en faire une coupe plus droite. Alors maintenant, je vais monter le tissu sur le, le mandrin. Vous voulez garder les mandrins à température ambiante car vous allez d’abord ajouter une couche d’OCT et vous ne voulez pas qu’elle gèle immédiatement parce que vous voulez que ce soit une belle couche plate.

Et nous allons utiliser cet engin ici pour un, c’est ce qu’on appelle un extracteur de chaleur. En fait, il sera utilisé pour aplatir l’OCT pendant qu’il gèle. Donc, ce que je fais d’abord, c’est que je prends le contrôle de la température ambiante et je le place dans ce support ici.

Prenez quelques-unes de mes bulles OCT. Peu importe ici car ils seront évincés. Il suffit d’ajouter un, un peu, pas vous n’avez pas besoin de beaucoup.

Prenez l’extracteur de chaleur et installez-le juste là. Attendez quelques secondes. Et puis là, vous pouvez voir que l’OCT est beau et plat.

Alors maintenant, j’ai mon tissu et je dois marquer l’OCT réel. D’accord, je vais donc marquer un point sur le, l’OCT à, pour indiquer sa position. Donc là, je viens de marquer le haut avec un point bleu.

Alors maintenant, je vais retirer le bloc de tissu du moule et je le fais simplement en poussant contre l’arrière de celui-ci. Je vais donc pousser doucement sur le dos et le pousser dans ma main, mais encore une fois, je ne veux pas qu’il décongèle. Alors je l’ai remis tout de suite.

Alors maintenant, vous pouvez voir le, le bloc de tissu avec la, la marque bleue que j’ai mise dessus. Je sais donc que c’est le haut de la tête de l’embryon. Et je veux sectionner à travers le visage parce que ce sont des sections coronales.

Alors maintenant, ce que je vais faire, c’est ajouter une autre gouttelette de grosse gouttelette OCTA, et je dois agir rapidement maintenant parce que tout est froid. Et je prends mon mouchoir et le place en plein milieu, je m’assure qu’il est à plat contre le, le lit d’OCT déjà fait. Maintenant, je vais simplement laisser cela se figer et cela prendra environ une minute ou deux.

Alors maintenant, il a fini de geler. Et je vais prendre le tissu qui est monté sur le, sur le mandrin, le placer dans la tête, le mettre aussi droit que possible, puis serrer. C’est possible, c’est agréable et serré.

Je vais le placer juste devant la lame puis l’avancer, ce qui peut prendre plusieurs secondes. D’accord, maintenant je vais utiliser le bord plat de la lame pour vraiment faire un positionnement fin du tissu. Donc, je vais simplement regarder le bord et balancer le tissu de haut en bas juste pour m’assurer que les bords s’alignent.

S’ils ne le faisaient pas, vous savez, cela pourrait ressembler à quelque chose comme ça. J’exagère évidemment, mais vous pouvez voir ici que c’est, ce n’est pas droit contre la lame. Alors je continue à faire des ajustements jusqu’à ce que je sente que c’est aussi droit que possible.

Je pense que c’est plutôt bien. Donc, je regarde, sous tous les angles, pour m’assurer que le tissu va couper droit contre la lame et j’utilise le bord de la lame pour l’indiquer. Donc, je regarde au-dessus et je regarde de côté et le tissu a l’air plutôt bien.

Je n’ai pas besoin de faire beaucoup de réglages, mais si je le faisais, j’utiliserais simplement les boutons qui se trouvent à l’arrière de la tête. Et en les tournant à gauche ou à droite, vous pouvez voir que vous pouvez faire des ajustements fins de cette façon. Mais ça a l’air plutôt bien.

Maintenant, je suis en train de faire progresser le tissu. C’est, il ne coupe pas encore parce qu’il n’est pas contre la lame. Le tissu est profondément ancré à l’intérieur de l’OCT.

Cela peut donc prendre plusieurs minutes pour atteindre le tissu. Vous ne voulez pas aller trop vite parce qu’il pourrait attraper et fissurer l’OCT et vos tissus, mais vous ne voulez pas non plus aller trop lentement car cela pourrait prendre une éternité. Il y a une fonction intéressante sur cette machine où vous pouvez faire une coupe à une section plus épaisse, ce qui vous permettra d’aller plus vite.

Alors maintenant, je suis en fait, je coupe à travers le, l’OCT maintenant, donc je ralentis un peu. Je ne suis donc pas encore arrivé au tissu, mais c’est le moment où j’évalue comment la section va se dérouler. De nombreuses variables peuvent faire en sorte que votre section de tissus se déroule vraiment bien ou vraiment mal.

Ce que je trouve qui se passe le plus souvent avec ce cryostat, c’est que le tissu est en fait un, un peu trop froid. J’ai, j’ai baissé la température, mais il semble quand même qu’il fasse un peu trop froid. Et ce qui se passe, c’est que la lame va claquer à travers le, à travers le tissu ou et à travers l’OCT.

Vous obtiendrez donc ces petites lignes, ces lignes horizontales à travers le, à travers l’OCT. Ce que je fais, c’est que je prends mon pouce et je vais simplement réchauffer le bord, réchauffer l’OCT simplement en le touchant doucement, en faisant glisser mon pouce, pas très longtemps. Et puis quand je l’ai parcouru, j’ai remarqué qu’ils ressortaient beaucoup mieux et que le bavardage avait cessé.

C’est donc le genre de choses que je vais, je vais, je vais évaluer avant d’arriver aux tissus. J’ai donc remarqué qu’au fur et à mesure que la lame traverse le tissu, il y a un accroc ou, ou une fissure, en fait dans l’OCT. Donc, l’une des choses que je fais en premier est de changer la lame.

Je ne sais pas depuis combien de temps cette lame est ici et qui l’a utilisée avant moi, donc je vais juste aller de l’avant et sortir une nouvelle lame. Ceux-ci sont évidemment très tranchants, il faut donc faire attention. Je vais donc ajuster la plaque anti-roulis et il y a une vis à ressort sur le fond ici que vous n’avez qu’à passer sous laquelle vous pouvez la déplacer vers l’intérieur ou vers l’extérieur.

J’ai donc suffisamment avancé et sectionné pour que je sois maintenant dans le tissu. Et malheureusement, il y a une fissure dans le bloc d’OCT, ce qui arrive souvent et malheureusement vous ne pouvez pas vraiment le contrôler, mais il y a des choses que vous pouvez faire pour le réparer. Si la fissure a traversé le tissu, vous devez jeter l’échantillon ou essayer de récupérer ce que vous pouvez.

Dans ce cas, la fissure semble être au-dessus du tissu. Donc, ce que je vais faire, c’est prendre une lame de rasoir qui a été dedans, dans le cryostat. C’est, c’est froid.

Et je vais essayer de couper la partie fissurée, qui se trouve en haut du bloc OCT. Donc, encore une fois, je vais utiliser mon pouce pour, pour chauffer la face du bloc OCT. Et puis je vais faire une section, et si vous pouvez le voir ici, c’est fissuré.

Alors là, j’ai enlevé le morceau avec le mouchoir et puis le reste de l’oct OCT que je viens de jeter, c’était la partie fissurée. Donc, ce que je vais faire, c’est essayer de couper cette partie fissurée à l’aide d’une lame de rasoir refroidie. Je dois entrer très droit et je dois utiliser les deux mains et appliquer une pression uniforme sur la lame.

Et je vais balancer la lame d’avant en arrière dans l’OCT. Alors je me balance d’avant en arrière, coupant lentement dans l’OCT. J’espère que j’enlève la partie fissurée.

D’accord, je vais réduire en supprimant cet excès d’OCT. D’accord, ça a l’air bien. Je vais ensuite rétracter légèrement la tête parce que j’ai créé des bords qui peuvent s’accrocher à la lame, et si cela se produit, cela pourrait en fait casser l’OCT et le tissu et ce qui ruinerait mon échantillon.

Je me suis donc rétracté, donc je vais devoir avancer un peu plus pour revenir dans le tissu et, espérons-le, j’ai corrigé la fissure. D’accord, maintenant je reviens dans les tissus. D’accord, on dirait que je, je l’ai corrigé.

Il n’y a donc plus de fissures dans l’OCT qui faciliteront grandement la capture des sections. Alors maintenant, je vais passer à la partie du tissu qui m’intéresse. En ce moment, je suis, je viens juste de frapper la surface et j’aimerais entrer dans le, le cerveau de cet embryon.

Ceux-ci sont assez grands pour que je puisse réellement voir les structures qui m’intéressent. J’ai omis de mentionner que j’utilise ces pinceaux pour nettoyer la lame entre chaque section que je vais capturer. Ce grand est juste pour nettoyer la, la zone et, et enlever l’excès d’ooc OCT.

J’utilise également ces pinceaux plus fins pour manipuler la section contre cette plaque froide ici afin de la positionner lorsque je la capture sur la section. Encore une fois, ceux-ci sont conservés au froid, de sorte que l’OCT ne fond pas et ne colle pas aux pinceaux. Donc, pour capturer le tissu, je vais d’abord chauffer l’OCT et le tissu avec mon pouce.

Et je vais prendre l’une de ces diapositives que j’ai déjà étiquetées. Je le tiens à l’envers et tout le monde le fait différemment. Mais la façon dont je le fais, c’est que j’aime tenir ce coin supérieur droit lorsque la diapositive est tournée vers le bas avec ma main droite.

Ensuite, j’utilise mon pouce gauche comme point de pivot pour pouvoir descendre directement contre la plaque et capturer la section. L’OCT et le tissu fondront en fait contre la lame et se monteront tout seuls. Donc, d’abord, je vais réchauffer le mouchoir avec mon pouce, le sectionner lentement, saisir ma diapositive, tenir le coin droit avec ma main droite, déplacer la plaque, l’abaisser tout droit, la laisser fondre.

Je vais regarder le mouchoir pour m’assurer qu’il n’y a pas de plis ou de bulles et qu’il a l’air bien. Et je continuerai à faire cela jusqu’à ce que je traverse tout le cerveau. Je regarde maintenant les sections à travers la lunette de dissection pour m’assurer qu’elles ont l’air bien et qu’elles le font, vous pouvez voir le, le cerveau antérieur en haut de la section et elles ont toutes l’air très belles.

Vous pouvez utiliser ces sections cryogéniques pour des choses comme l’hybridation in situ. Nous faisons parfois de l’histologie de base, des colorations h et e. Vous pouvez également faire de l’immunofluorescence et vous savez, un certain nombre de tests comme ça.

Pour moi en particulier, ces sections ont été fixées et traitées pour l’hybridation in situ. C’est donc ce que je vais faire ensuite.