Flash de congélation et Cryosectioning E12.5 cerveau de souris

Bonjour, je suis Spencer Curley de l'Université de Californie à Irvine et du laboratoire d'Ed Maki, et je vais vous montrer comment réaliser une cryosection. Pour cela, j'utilise tout d'abord ces réactifs couramment utilisés. Le composé d'inclusion, ou milieu d'inclusion, que j'utilise s'appelle OCT, pour optimal cutting temperature.

C'est une solution limpide, très épaisse et visqueuse, qui maintient bien le tissu en place pendant que vous l'orientez, puis elle gèle. En fin de compte, elle est soluble dans l'eau, ce qui permet de l'éliminer pendant toute procédure de coloration. J'incorpore donc le tissu dans un moule. Ces récipients-biopsie en cryomoule existent en différentes tailles.

J'utiliserai ce petit moule ici car je travaille avec des tissus embryonnaires de souris. Nous congélons rapidement nos tissus dans de l'azote liquide. Tout d'abord, je vais remplir cette fiole vide sous vide protectrice avec de l'azote liquide à partir de notre réservoir ici.

Avant de congeler rapidement le tissu, vous devez procéder à une cryoprotection du tissu, sinon le gel lui-même détruirait le tissu. Pour cela, vous immergez le tissu dans une solution de saccharose à 30 % pendant toute une nuit. Et s’il faut plus de temps, ce n’est pas grave, du moment que le tissu coule.

Et comme vous pouvez le constater, les têtes de souris au stade embryonnaire 12,5 ont coulé dans la solution de saccharose, elles sont donc prêtes à être congelées. Je vais maintenant simplement verser le tissu se trouvant dans la solution de saccharose dans une boîte plus grande afin de pouvoir manipuler le tissu. Je vais prendre un peu de OCT et le verser dans cette boîte de 35 millimètres qui repose en réalité sur son couvercle, afin de l'incliner correctement.

Ainsi, l’OCT s’accumule le long du bord pour la profondeur. J’utilise donc une paire de forceps émoussés plus anciens, simplement parce qu’il n’est pas nécessaire qu’ils soient pointus et que l’on ne veut pas abîmer une autre paire de forceps. Je les prends donc et je soulève délicatement l’une de ces têtes pour la placer dans ce premier bain d’OCT.

Je souhaite simplement recouvrir l'embryon de OCT. Cela permet une congélation du tissu meilleure et plus uniforme. Vous ne devez pas avoir de saccharose résiduel autour du tissu ni de bulles d'air.

Évitez absolument les bulles d'air. Je mélange donc doucement l'OCT autour et sous la tête, en déplaçant la tête dans l'OCT, puis je laisse reposer quelques secondes pendant que je remplis mon moule à cryo-inclusion. Maintenant, je vais remplir le moule à cryo-inclusion avec l'OCT, en évitant à nouveau les bulles.

Et je vais simplement le remplir jusqu’en haut du moule. Comme vous pouvez le remarquer, j’ai étiqueté le moule. Ainsi, je pourrai voir son orientation une fois qu’il sera congelé.

Lorsque l’OCT gèle, il devient blanc et vous ne pouvez plus voir votre tissu. Il est donc essentiel de marquer le moule à cryo-inclusion au marqueur indélébile.

J'ai effectivement obtenu une bulle dans l'OCT, donc je vais utiliser ma pince pour la repousser par-dessus le bord. Vous ne voulez pas qu'elle interfère avec la congélation de votre tissu. Je vais maintenant transférer la tête depuis cette boîte vers l'OCT présent dans mon moule.

Je vais simplement le soulever hors de la boîte et le placer très délicatement dans le moule. Ensuite, je vais passer au microscope où j'orienterai le tissu. J'ai le tissu dans mon moule cryogénique ici, et je vais regarder à travers l'oculaire afin de pouvoir l'orienter.

Je vais réaliser des coupes coronales à travers cette tête de souris. Je dois donc l'orienter correctement afin de la positionner dans le cryostat pour des coupes coronales. Encore une fois, j'utilise ces anciennes pinces émoussées et, comme vous pouvez le voir, il y a quelques bulles ici ; je vais faire de mon mieux pour les éliminer.

Mais ces petites bulles ne sont pas, ne sont pas mauvaises. Je n'ai rien remarqué concernant ces petites bulles. Vous ne voulez simplement pas de grosses bulles.

Je vais donc simplement les déplacer du mieux que je peux et essuyer certainement souvent la pince, car vous pouvez ainsi mieux éviter les bulles. Et maintenant, si vous voyez mon étiquetage, j'ai un « t » en haut et un « F » à ma gauche ici. Cela m'indique simplement que la tête, le sommet de la tête, sera orienté vers le haut et que l'avant ou le visage sera à ma gauche.

Ainsi, je sais quel plan sectionner pour obtenir des coupes coronales, et je déplace simplement le tissu. Encore une fois, cela peut parfois introduire des bulles, qu’il faut simplement repousser pour éviter qu’elles ne gèlent en même temps que le tissu. La présence de bulles est problématique, principalement parce que, lors de la congélation, elles peuvent provoquer une congélation irrégulière du tissu.

L'objectif de la congélation rapide est de tout congeler instantanément. De plus, lors de la coupe du tissu au cryostat, si la lame traverse une bulle au lieu du milieu OCT ou du tissu lui-même, cela peut provoquer un accrochage ou une déchirure, et ainsi endommager ou briser le tissu. Il est donc essentiel d'éviter ces bulles à tout prix.

Les plus gros en particulier. Je continue donc de l'orienter ici. Ce tissu a été fixé pendant 24 heures, il est donc assez résistant à mes manipulations.

Un autre tissu pourrait être un peu plus mou, il faut donc être très délicat. Une fois que je l'ai positionné sous le microscope avec la face à gauche et le sommet de la tête vers le haut, je dois m'assurer qu'il est correctement orienté dans les autres plans également. Je vais donc soulever et observer à travers toutes les faces du cube pour vérifier qu'il est bien positionné.

Et je vois qu’il est légèrement incliné vers le bas, donc je dois simplement soulever avec ma pince. D’accord ? Et cela nécessite certainement beaucoup d’entraînement. D’accord, cela a l’air bon.

Maintenant, je vais venir ici et la congeler dans de l'azote liquide. Bon, maintenant que le tissu est correctement orienté dans le moule cryogénique, je vais verser mon azote liquide dans cette boîte ici. Il s'agit simplement d'une boîte de Pétri en plastique normale pour culture de tissus, remplie jusqu'au bord.

Il s'évapore assez rapidement. Je vais prendre ma pince et abaisser le moule cryogénique. Et comme vous pouvez le voir, j'ai effectivement courbé le bord inférieur.

Cela permet certainement une manipulation meilleure et plus aisée. Je vais le congeler. Et au fur et à mesure que le tissu et l’OCT gèlent, ils deviennent blancs et solides.

Et une fois que c’est terminé, tout deviendra blanc. Ensuite, je dois rapidement placer le tissu congelé dans l’enceinte à −80 °C pour le stocker. Vous devez le tenir de manière à ce que le tissu ne soit pas immergé.

Vous devez donc être très prudent et le maintenir juste à la surface supérieure de l'azote liquide. Très bien, maintenant il est congelé. Maintenez-le encore quelques secondes supplémentaires avant de passer au moins 80.

D'accord, maintenant je vais l'apporter au congélateur à -80. J'ai donc pris mon tissu provenant du congélateur à -80 et je l'ai placé dans ce cryostat ici. La chambre est effectivement à une température de -24 degrés Celsius.

Pour l'instant, vous devez laisser le tissu s'équilibrer pendant environ une demi-heure à une heure avant de commencer la coupe. Sinon, il est trop fragile. Bien que tous les cryostats soient différents, je vais simplement indiquer quelques éléments de base concernant cette machine ici.

Nous utilisons donc le Leica CM 30 50 s. C'est une bonne machine car elle dispose d'une unité de refroidissement séparée pour l'échantillon lui-même, ce qui constitue un avantage appréciable. Vous pouvez régler la température de l'échantillon, et différentes températures sont nécessaires selon les tissus pour la coupe.

Lorsque vous chargez votre tissu pour la première fois, vous devez effectuer plusieurs réglages. Ceux-ci sont similaires sur tous les cryostats. Ces appareils comportent des composants électroniques, dont certains sont actionnés manuellement.

Par exemple, vous devrez rétracter le bras du cryostat ou l'avancer pour le positionner plus près ou plus loin de la lame. Vous pouvez le faire rapidement ou lentement. Vous pouvez régler l'épaisseur de votre coupe à l'aide de ce plus ou moins ici.

Et vous choisirez entre le réglage de la lame ou de l'épaisseur des sections, indiqué sur le bouton central ici. Vous réglerez ensuite la température de la chambre ou de l'échantillon lui-même, près de cet affichage numérique, simplement en appuyant sur ce bouton et en utilisant ces flèches haut et bas pour ajuster la température. Ainsi, pour nous, lorsque nous réalisons des cryosections, nous utilisons ces lames microscopiques Superfrost Plus de la marque Fisher.

Ils sont recouverts d'un adhésif afin que le tissu ne se détache pas pendant le traitement. Parfois, lors de la coupe, vous remarquerez que le tissu semble un peu mou ; certains signes révélateurs sont qu'il touche la lame et s'agglomère. Pour corriger cela, vous pouvez utiliser ce congélateur super amical de la marque Fisher.

Il, euh, il congèle rapidement le tissu et vous l'orientez simplement vers votre tissu, puis appuyez sur la gâchette ; il recongelera rapidement le tissu s'il est trop mou. Avant de monter le tissu sur un porte-échantillon pour la coupe, je souhaite vous faire rapidement visiter quelques éléments de cet appareil. Voici l'endroit où vous insérez effectivement le couteau, qui est fixé à l'aide de cette plaque métallique.

En soulevant ce bras, vous pouvez effectivement retirer et remplacer la lame selon les besoins. Assurez-vous qu'elle est bien fixée. Ne serrez pas trop la lame, sinon elle risque de se déformer.

Vous remarquerez que l'épaisseur du tissu dans vos coupes n'est pas uniforme. Vous ne devez donc pas enfoncer complètement ce bras. Vous devez simplement le positionner de manière à ce qu'il soit à peu près au niveau de la lame elle-même.

Voici un autre élément que vous devrez peut-être régler lors de la coupe. Il s'agit de la plaque anti-roulis. C'est un morceau de verre qui s'insère dans ce support-ci et que vous pouvez ajuster à l'aide de cette vis à ressort ici.

Et vous le déplacez essentiellement vers l’avant ou vers l’arrière. Cela permet de maintenir votre tissu ou vos sections à plat afin que vous puissiez les monter sur une lame. Une autre chose que vous pouvez être amené à régler pendant la coupe est l’endroit sur le couteau qui effectue réellement la découpe.

Alors, comment procédez-vous pour ajuster cela ? Il suffit de soulever ce levier pour faire glisser tout ce dispositif vers la gauche ou la droite. Vous n'utilisez cela que si vous remarquez que votre tissu accroche sur une partie précise de la lame, ou si vous souhaitez préserver les lames, car elles sont assez coûteuses. Ainsi, vous pouvez trouver une zone parfaitement propre simplement en déplaçant ce mécanisme d'avant en arrière.

Un autre paramètre que vous pouvez régler est l'angle de coupe. Sur le côté, à un endroit que vous ne pourrez pas voir, il existe trois positions différentes. Nous utilisons simplement la position centrale, que vous réglez en soulevant ce levier.

Et, cela peut, vous pouvez faire monter et descendre cet appareil. Nous le gardons toujours au milieu. Je vais donc simplement le laisser à cette position pour l'instant.

Donc, ceci à l'arrière est la tête du cryostat. Elle maintient en réalité l'échantillon de tissu congelé pendant qu'il est sectionné. Elle se déplace vers le haut et le bas et avance vers le couteau.

Et fondamentalement, vous fixez le tissu sur ce mandrin ici, nous placerons ensuite le mandrin dans la tête, le serrerons, puis utiliserons ces molettes à l’arrière pour ajuster l’angle et obtenir une coupe plus droite. Maintenant, je vais fixer le tissu sur le mandrin. Vous devez garder les mandrins à température ambiante, car vous allez d’abord ajouter une couche de OCT, et vous ne voulez pas qu’elle gèle immédiatement, car vous souhaitez obtenir une couche bien plane.

Et nous allons utiliser cet appareil ici pour, on l'appelle un extracteur de chaleur. En réalité, il servira à aplatir le OCT lors de sa congélation. Ce que je fais d'abord, c'est prendre l'échantillon à température ambiante et le placer dans ce support ici.

Prenez un peu de mes bulles de OCT. Cela n'a pas d'importance ici, car elles seront expulsées. Ajoutez simplement un tout petit peu, pas besoin de beaucoup.

Prenez l'extracteur thermique et placez-le simplement juste là. Attendez quelques secondes. Vous pouvez alors constater que l'OCT est bien plat.

Donc maintenant, j'ai mon tissu et je dois marquer l'OCT réel. Très bien, je vais marquer un point sur l'OCT pour indiquer sa position. Voilà, je viens de marquer le haut avec un point bleu.

Je vais maintenant retirer le bloc de tissu du moule en appuyant doucement sur son arrière. Je vais donc pousser délicatement sur l'arrière pour le faire glisser dans ma main, mais encore une fois, je ne veux pas qu'il dégèle. Je le remets donc immédiatement à l'intérieur.

Vous pouvez maintenant voir le bloc de tissu avec la marque bleue que j'ai placée dessus. Je sais donc que c'est le sommet de la tête de l'embryon. Et je souhaite réaliser des coupes à travers le visage, car il s'agit de sections coronales.

Je vais maintenant ajouter une autre goutte d’OCT, une goutte plus grande, et je dois agir rapidement car tout est froid. Je vais prendre mon tissu et le placer exactement au milieu, en m'assurant qu'il soit bien à plat contre le lit d’OCT déjà formé. Je vais maintenant laisser prendre cette préparation, ce qui prendra environ une à deux minutes.

Le congélation est donc maintenant terminée. Je vais prendre le tissu fixé sur le porte-échantillon, le placer dans la tête, le positionner aussi droit que possible, puis serrer. Il est bien fixé, c'est parfaitement serré.

Je vais le placer juste devant la lame, puis l'avancer, ce qui peut prendre plusieurs secondes. Bien, maintenant je vais utiliser le bord plat de la lame pour effectuer un positionnement précis du tissu. Je regarde simplement le bord et je balance doucement le tissu vers le haut et vers le bas afin de m'assurer que les bords s'alignent correctement.

S'ils ne l'ont pas fait, vous savez, cela pourrait ressembler à ceci. Je l'exagère évidemment, mais vous pouvez voir ici que ce n'est pas bien droit par rapport au, à la lame. J'effectue donc simplement des ajustements jusqu'à ce que je sente que c'est aussi droit que possible.

Je pense que c'est assez bon. J'observe donc sous tous les angles pour m'assurer que le tissu va être coupé droit contre la lame, et j'utilise le bord de la lame pour le vérifier. Je regarde donc par-dessus et sur le côté, et le tissu semble en réalité assez bien positionné.

Je n'ai pas besoin d'effectuer beaucoup de réglages, mais si c'était nécessaire, j'utiliserais simplement les molettes situées à l'arrière de la tête. En les tournant vers la gauche ou la droite, on peut observer que des ajustements fins sont possibles de cette manière. Mais cela semble déjà assez bon.

Maintenant, je suis en train d'avancer le tissu. Il n'est pas encore coupé, car il ne touche pas encore le bord du couteau. Le tissu est profondément inclus dans l'OCT.

Il peut donc falloir plusieurs minutes pour atteindre le tissu. Vous ne devez pas aller trop vite, car cela pourrait accrocher et fissurer l’OCT ainsi que votre tissu, mais vous ne devez pas non plus aller trop lentement, car cela pourrait prendre une éternité. Cette machine possède une fonction pratique qui permet d’effectuer un écrêtage avec une coupe plus épaisse, ce qui vous permet d’avancer plus rapidement.

Donc maintenant, je suis en train de couper effectivement dans l’OCT, je ralentis donc un peu. Je n’ai pas encore atteint le tissu, mais c’est le moment où j’évalue comment se déroulera la coupe. De nombreuses variables peuvent faire que la sectionnement du tissu se passe très bien ou très mal.

Ce que je constate le plus souvent avec ce cryostat, c’est que le tissu est en réalité un peu trop froid. J’ai réduit la température, mais il semble tout de même qu’elle soit un peu trop basse. Ce qui se produit alors, c’est que la lame vibre en traversant le tissu ou encore l’OCT.

Vous obtiendrez ainsi de fines lignes, des lignes horizontales à travers l'OCT. Ce que je fais, c'est prendre mon pouce et réchauffer légèrement le bord, réchauffer l'OCT en le touchant doucement et en faisant glisser mon pouce, mais pas très longtemps. Ensuite, lorsque je réalise les coupes, je remarque qu'elles sortent beaucoup mieux et que le phénomène de vibration a disparu.

Voilà donc les éléments que j’évalue avant d’arriver au tissu. J’ai remarqué que, lorsque la lame traverse le tissu, il y a un accrochage ou, en réalité, une fissure dans l’OCT. L’une des premières choses que je fais est donc de changer la lame.

Je ne sais pas depuis combien de temps cette lame est en place ni qui l'a utilisée avant moi, donc je vais simplement prendre une nouvelle lame. Elles sont évidemment très tranchantes, il faut donc faire attention. Je vais maintenant régler la plaque anti-roulement, qui comporte ici, en bas, une vis à ressort que vous pouvez atteindre par en dessous pour la déplacer vers l'intérieur ou vers l'extérieur.

J'ai donc effectué suffisamment d'avancées et de sectionnements pour être maintenant dans le tissu. Malheureusement, une fissure traverse le bloc d’OCT, ce qui arrive fréquemment et, malheureusement, on ne peut pas vraiment la contrôler, mais il existe des moyens de la corriger. Si la fissure avait traversé le tissu, il faudrait alors jeter l'échantillon ou tenter de récupérer ce qui est encore utilisable.

Dans ce cas, la fissure semble se situer au-dessus du tissu. Ce que je vais donc faire, c'est prendre une lame de rasoir qui a été placée dans le cryostat. Elle est refroidie.

Et je vais essayer de simplement couper la partie fissurée, située au sommet du bloc OCT. Encore une fois, j'utiliserai mon pouce pour réchauffer la surface du bloc OCT. Ensuite, je vais réaliser des coupes, et si vous pouvez le voir ici, il est fissuré.

Donc, j'ai retiré la partie contenant le tissu, puis le reste de l'OCT que j'ai simplement éliminé, car il s'agissait de la partie fissurée. Ce que je vais faire, c'est essayer de découper cette partie fissurée à l'aide d'une lame de rasoir refroidie. Je dois couper très droit et utiliser les deux mains en appliquant une pression uniforme sur la lame.

Et je vais balancer la lame d'avant en arrière dans l'OCT. Je balance donc d'avant en arrière, en coupant lentement dans l'OCT. J'espère ainsi éliminer la partie fissurée.

D'accord, je vais découper en éliminant cet excès d'OCT. D'accord, cela semble bon. Ensuite, je vais légèrement rétracter la tête, car j'ai créé des bords qui pourraient accrocher la lame ; si cela se produisait, cela risquerait de briser l'OCT et le tissu, ce qui endommagerait mon échantillon.

J'ai donc effectué une rétraction, je dois donc avancer un peu plus pour revenir dans le tissu et, espérons-le, j'ai corrigé la fissure. Très bien, je suis de nouveau en train de pénétrer dans le tissu. D'accord, il semble que j'ai effectivement corrigé la fissure.

Il n’y a donc plus aucune fissure dans l’OCT, ce qui facilitera grandement la récupération des sections. Je vais maintenant avancer jusqu’à la partie du tissu qui m’intéresse. Pour l’instant, je viens tout juste d’atteindre la surface, et je souhaite pénétrer à l’intérieur du cerveau de cet embryon.

Ils sont suffisamment grands pour que je puisse effectivement voir les structures qui m'intéressent. Je n'ai pas mentionné que j'utilise ces pinceaux pour nettoyer la lame entre chaque coupe que je vais prélever. Ce grand pinceau sert simplement à nettoyer la zone et à éliminer l'excès d'OCT.

J'utilise également ces pinceaux plus fins pour manipuler la coupe contre cette plaque froide afin de la positionner lors de sa capture sur la coupe. Encore une fois, ces pinceaux sont maintenus au froid pour que l'OCT ne fonde pas et n'adhère pas aux pinceaux. Pour capturer le tissu, je vais d'abord réchauffer l'OCT et le tissu avec mon pouce.

Et je vais prendre l'une de ces lames que j'ai déjà étiquetées. Je la tiens à l'envers et chacun le fait différemment. Mais moi, je préfère tenir ce coin supérieur droit, lorsque la lame est orientée vers le bas, avec ma main droite.

Ensuite, j'utilise mon pouce gauche comme point d'appui afin de descendre directement contre la lame et capturer la coupe. L'OCT et le tissu vont effectivement fondre contre la lame et s'y fixer spontanément. Tout d'abord, je réchauffe doucement le tissu avec mon pouce, effectue la coupe, prends ma lame, tiens le coin droit avec ma main droite, déplace la plaque, l'abaisse verticalement, puis laisse fondre.

J'examine le tissu pour m'assurer qu'il n'y a ni plis ni bulles et qu'il a un aspect satisfaisant. Je continue ce processus jusqu'à ce que je sois passé à travers tout le cerveau. J'examine maintenant les sections au microscope stéréoscopique pour vérifier qu'elles ont un bon aspect, ce qui est le cas ; on peut voir le prosencéphale en haut de la section, et toutes ont l'air très bien.

Vous pouvez utiliser ces coupes cryogéniques pour des applications telles que l'hybridation in situ. Nous réalisons parfois des examens histologiques de base, comme les colorations H&E. Vous pouvez également effectuer de l'immunofluorescence et, comme vous le savez, un certain nombre de tests de ce type.

Pour ma part, ces sections ont été fixées et traitées pour l'hybridation in situ. C'est donc ce que je vais faire ensuite.