Name: Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Apprenez la préparation des cellules S2 de Drosophila pour la microscopie optique en utilisant le lectine ConA. Cette méthode permet d'étudier la localisation des protéines et la biologie cellulaire avec une excellente adhésion.

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Ce travail a été soutenu en partie par le National Cancer Institute P30 CA23074, la American Cancer Society Research Grant 74-001-31 institutionnels, et l&#39;Univ. de l&#39;Arizona IG SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Pour le domaine de la biologie cellulaire, un système idéal serait peu coûteux à entretenir, facile à manipuler, et se prêtent à une variété de techniques. Cellules S2 de drosophile satisfaire à ces exigences, et donc ils sont rapidement devenus le système de choix pour un nombre croissant de cellules les laboratoires de biologie. Nous avons présenté un bref aperçu des méthodes pour préparer les cellules S2 pour la microscopie. Une vertu notable de cellules S2 est le fait qu&#39;ils...

<table><tbody><tr><td>Cellules S2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cellules S2</td><td>DGRC</td><td>numéro de stock 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cellules S2</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>milieu sans sérum</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>milieu sans sérum</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>milieu sans sérum</td></tr><tr><td>Milieu Schneider&amp;rsquo;s S2</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Ajouter 10 % (concentration finale) de FBS inactivé par la chaleur pour obtenir un milieu complet.</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inactivé par la chaleur</td></tr><tr><td>Solution antibiotique 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>contient de la pénicilline (10000 U/mL),&lt;br/&gt;de la streptomycine (10000 &amp;#x03BC;g/mL) et&lt;br/&gt;de l'amphotéricine B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavaline A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>solution à 32 %</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anhydre, qualité ACS</td></tr><tr><td>Cribles moléculaires</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>type 3A</td></tr></tbody></table>

préparation des drosophile les cellules s2 pour la microscopie optique

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Le système idéal d&#39;expérimentation serait bon marché et facile à entretenir, se prêtant à une variété de techniques, et serait soutenu par une abondante littérature et de base de données la séquence du génome. Des cultures de cellules S2 de drosophile, le produit des embryons de 20 à 24 heures dissocié ancienne 1, possèdent toutes ces propriétés. Par conséquent, les cellules S2 sont extrêmement bien adapté pour l&#39;analyse des processus cellulaires, y compris la découverte des gènes codant pour les composants moléculaires du processus ou mécanisme d&#39;intérêts. Les caractéristiques des cellules S2 qui sont les plus responsables de leur utilité sont la facilité avec laquelle ils sont maintenus, leur sensibilité exquise à double brin (ds) ARN médiée par l&#39;interférence ARN (ARNi), et leur traçabilité à la microscopie par fluorescence que ce soit en direct ou fixes cellules. Les cellules S2 peuvent être cultivés dans une variété de médias, y compris un certain nombre de bon marché, disponibles dans le commerce, entièrement défini, un milieu sans sérum 2. De plus, ils poussent de façon optimale et rapide à 21-24 ° C et peuvent être cultivées dans une variété de conteneurs. Contrairement aux cellules de mammifères, les cellules S2 ne nécessitent pas une atmosphère régulée, mais plutôt bien faire avec l&#39;air normal et peut même être maintenu dans des flacons étanches. Complétant la facilité de l&#39;ARNi dans les cellules S2 est la capacité à analyser les phénotypes facilement induite expérimentalement par phase ou la microscopie à fluorescence de cellules fixées ou vivantes. Les cellules S2 grandir dans la culture comme une seule monocouche, mais ne pas afficher l&#39;inhibition de contact. Au lieu de cela, les cellules ont tendance à croître en colonies dans les cultures denses. A faible densité, les cultures cultivées sur S2 en verre ou en culture de tissus traités en plastique sont ronds et peu-joint. Toutefois, l&#39;examen cytologique des cellules S2 peut être grandement améliorée en les incitant à aplatir en cultivant intensivement brièvement eux sur une surface revêtue de la lectine, la concanavaline A (ConA) 3. Les cellules S2 peut aussi être transfectées de façon stable avec des marqueurs marqués par fluorescence à des structures étiquette ou organites d&#39;intérêt dans les cellules vivantes ou fixées. Par conséquent, le scénario habituel pour l&#39;analyse microscopique des cellules est la suivante: d&#39;abord, les cellules S2 (qui peuvent posséder des transgènes à exprimer des marqueurs marqués) sont traitées par RNAi pour éliminer une protéine cible (s). Temps de traitement ARNi peut être ajusté pour tenir compte des différences dans les protéines turn-over cinétique et pour minimiser les traumatismes de cellules / décès si la protéine cible est importante pour la viabilité. Ensuite, les cellules traitées sont transférés dans une boîte contenant une lamelle pré-enduites de conA d&#39;induire les cellules à se répandre et bien adhérer au verre. Enfin, les cellules sont imagés avec le choix du chercheur de modes de microscopie. Les cellules S2 sont particulièrement bonnes pour les études nécessitant la visualisation prolongée des cellules vivantes, puisque ces cellules rester en bonne santé à la température ambiante et une atmosphère normale.

Drosophila Schneider (S2), les cellules sont un système de plus en plus populaire pour la découverte et l&#39;analyse fonctionnelle des gènes. Notre objectif est de décrire quelques-unes des techniques microscopiques qui rendent les cellules S2 un tel système en plus important d&#39;expérimentation.

Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

Le système expérimental idéal serait bon marché et facile à entretenir, adaptable à diverses techniques, et s'appuierait sur une littérature abondante...

L'objectif général de cette procédure est de décrire la préparation de cellules S de Drosophila pour la microscopie optique. Cela est réalisé en préparant tout d'abord des boîtes de culture à fond en verre. La deuxième étape de la procédure consiste à recouvrir le fond en verre de la lectine conval.Afin de favoriser l'adhérence et l'aplatissement des cellules S2, la troisième étape de la procédure consiste à ajouter le milieu de culture et les cellules S2 dans la boîte de culture. La dernière étape de la procédure est de fixer et d'immunomarquer les cellules S2 dans la boîte de culture.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la localisation de protéines d'intérêt marquées avec quatre fluorochromes ou par immunomarquage, respectivement par microscopie de fluorescence de cellules S deux vivantes ou fixées. Bonjour, je suis Joey Club du laboratoire de Greg Rogers, Département de biologie cellulaire et d'anatomie à l'Université de l'Arizona. Je suis John Nye, également du laboratoire Rogers.Et je suis également Dan Buster, du laboratoire de Greg Rogers. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de préparer des cellules Drosophila S2 pour la microscopie optique.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la régulation de la duplication centrale chez Drosophila en analysant les modifications du nombre et de la structure des centrosomes suite à l'élimination ou à la surexpression de protéines régulatrices importantes. Commençons donc. Nous utilisons des boîtes de Pétri standard de 35 millimètres pour fabriquer nos boîtes à fond en verre.Ces boîtes à fond en verre maintiennent les cellules dans un état très proche de leurs conditions normales de culture, tout en permettant l'examen de cellules vivantes à travers un verre de qualité microscopique. Pour assembler les boîtes à fond en verre, on utilise comme surface de perçage une surface en mousse de polystyrène recouverte de ruban adhésif et dotée de parois épaisses. Placez la moitié inférieure d'une boîte de Pétri de 35 millimètres sur la surface de perçage, le fond de la boîte étant appuyé contre la mousse de polystyrène, tout en tenant fermement les côtés de la boîte ; utilisez alors un perceuse manuelle équipée d'un foret à grappin de trois quarts de pouce pour percer un trou à travers la boîte.Après avoir percé tous vos boîtes, utilisez un foret conique à grains abrasifs grossiers et d'un diamètre à peu près équivalent à celui du foret à métaux pour lisser le rebord extérieur des trous. Placez le perceuse sur le côté, le foret dépassant du bord de la paillasse. Maintenez la perceuse en place en posant un objet lourd mais malléable dessus, par exemple un sac en plastique résistant contenant 10 kilogrammes de sable.Utilisez le bouton de verrouillage pour maintenir le fonctionnement continu de la perceuse. Lissez le bord de votre plat en le tenant et en le déplaçant contre l'embout de meulage afin d'éliminer le bord rugueux du nouveau trou. Une fois que les bords extérieurs des trous ont été lissés, placez les fonds de plat dans un grand bec verseur et rincez-les plusieurs fois avec de l'eau distillée.Cela permettra d'éliminer les petits morceaux détachés de plastique ou de polystyrène, qui flotteront ensuite. Disposez les fonds de boîte à sécher. Une fois les boîtes sèches, préparez la colle Sard 180 4.Mélangez la résine et l'agent de durcissement selon un rapport pondéral de 10 pour 1 et remuez soigneusement. Appliquez un petit cercle de colle autour du trou percé sur la surface extérieure de chaque boîte. Ensuite, placez un couvre-objet par-dessus le trou, en contact avec la colle.La lame de verre doit être d'au moins environ un millimètre plus grande que le trou présent dans la boîte de Pétri et plus petite que le diamètre de la boîte. La lame de verre doit s'ajuster contre la boîte de manière lisse et uniforme. Mettez maintenant les boîtes de côté.Côté inférieur, jusqu'à séchage complet. Cela peut prendre un jour ou plus à température ambiante, mais vous pouvez accélérer le taux de polymérisation en plaçant les boîtes dans un incubateur chaud. Une fois les boîtes sèches, elles peuvent être recouvertes de la lectine con A ou con A. Nous utilisons la con A car les deux cellules qui se fixent sur des lamelles recouvertes de con A s'aplatissent largement et deviennent d'excellents spécimens pour la microscopie.Pour rev&ecirc;tre un plateau, &eacute;taler 10 microlitres de solution de conne sur la face sup&eacute;rieure du verre d'un plateau &agrave; fond de verre. Apr&egrave;s s&eacute;chage, st&eacute;riliser le plateau et son couvercle avec la lumi&egrave;re UV. Dans une hotte de culture cellulaire, orienter les pi&egrave;ces de mani&egrave;re &agrave; ce que leurs surfaces internes soient directement expos&eacute;es &agrave; l'ampoule UV et activer la lumi&egrave;re UV de st&eacute;rilisation pendant au moins 45 minutes.Des cellules S2 peuvent être cultivées dans divers milieux. Pour nos besoins, nous utilisons le milieu VITROGEN SF 902. Pour préparer des cellules S2 traitées par ARNi en vue de la microscopie, resuspendez délicatement les cellules et transférez-les dans une boîte en verre à fond recouvert de conne contenant deux millilitres de milieu. Les cellules saines qui entrent en contact avec la lame recouverte de conne adhéreront fermement à celle-ci et commenceront à s'étaler.Ce processus devrait être visible au bout d'environ 15 minutes et doit être complet entre 45 minutes et une heure. Étant donné que les cellules S deux peuvent être facilement maintenues dans des conditions normales de température et d'atmosphère de laboratoire, aucune condition ni aucun équipement particulier n'est nécessaire lors de l'observation au microscope pour éviter la déshydratation ; veillez simplement à maintenir un milieu suffisant dans la boîte placée sur le microscope. L'imagerie en temps réel de cellules S deux sur des durées prolongées est possible.La durée d'exécution de ces expériences est limitée uniquement par les problèmes habituels de photoblanchiment et de phototoxicité. Les deux cellules S peuvent être fixées soit sur une boîte avec fond en verre, soit sur un simple coverslip. Toutefois, dans cette vidéo, nous allons démontrer la fixation et l'immunomarquage dans une boîte avec fond en verre.Le méthanol et le formaldéhyde sont deux fixateurs couramment utilisés pour les cellules S. Pour la fixation des cellules au méthanol, commencez par refroidir environ 300 millilitres de méthanol anhydre dans un bécher en verre d'un litre couvert, placé dans un congélateur étanche aux explosions à moins 20 degrés Celsius. Lorsque le méthanol est suffisamment froid, retirez-le du congélateur. Retirez rapidement le milieu du plat à fond en verre, puis plongez immédiatement le plat dans le méthanol.Remettez rapidement le bécher contenant la boîte dans le congélateur et fixez les cellules pendant 10 à 15 minutes. Après 10 à 15 minutes, retirez la boîte du bécher, versez tout le méthanol restant et réhydratez les cellules. En ajoutant du PBST, les cellules sont désormais prêtes pour les procédures de coloration standard, comme cela sera démontré ultérieurement pour la fixation cellulaire.Avec le formaldéhyde, nous utilisons du formaldéhyde à 10 % et un tampon. Cette concentration relativement élevée de formaldéhyde est utilisée parce que les cellules S deux ne possèdent pas de filaments intermédiaires cytoplasmiques, qui aideraient sinon à maintenir la morphologie et l'organisation cellulaires pendant le processus de fixation. Fixer les cellules dans du formaldéhyde à 10 % pendant 10 à 15 minutes.Lorsque la fixation est terminée, versez le formaldéhyde dans un bécher de déchets et lavez les cellules fixées par trois rinçages rapides avec du PBST. Commencez la procédure d'immunomarquage en ajoutant un millilitre de solution de blocage sur les cellules fixées pendant 15 minutes. Nous utilisons habituellement 5 % de sérum de chèvre normal dans du PBST.Versez la solution de blocage et ajoutez directement l'anticorps primaire sur les cellules. Remettez le couvercle de la boîte de Pétri pour éviter l'évaporation de la solution d'anticorps et laissez l'anticorps incuber avec les cellules pendant 30 minutes à température ambiante. Au bout de 30 minutes, retirez la solution d'anticorps primaire.Utilisez une pipette de transfert pour ajouter deux millilitres de PBST dans la boîte et attendez cinq minutes avant de remplacer le PBST. Effectuez ensuite trois lavages avec du PBST. Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres d'anticorps secondaire directement sur les cellules.Remettez le couvercle de la boîte de Pétri et laissez l'anticorps incuber avec les cellules pendant 30 minutes à température ambiante. Une fois les 30 minutes écoulées, retirez l'anticorps secondaire et effectuez trois lavages de cinq minutes chacun avec du PBST.Enfin, ajoutez quelques gouttes de milieu de montage directement sur les cellules. Remettez le couvercle de la boîte de Pétri et, si nécessaire, conservez la boîte à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Ci-dessous, des images représentatives en contraste de phase de cellules S deux après ensemencement sur une boîte à fond en verre revêtu de conval, les chiffres indiquant les minutes écoulées après l’ensemencement.L'aplatissement spontané est visible au bout de 15 minutes et est essentiellement terminé après 60 minutes. Remarquez que les cellules deviennent plus sombres en contraste de phase lorsqu'elles s'aplatissent sur la lamelle recouverte. Sur cette image agrandie de cellules attachées, leurs bords étendus et aplanis, indiqués par la flèche, sont clairement visibles.Deux cellules S peuvent être transfectées pour exprimer des protéines marquées par un fluorophore qui révèlent des structures d'intérêt dans des cellules fixées ou vivantes. Dans cet exemple, des cellules S ont été transfectées de manière transitoire avec une construction d'union comprenant la nucléophoine, un marqueur du noyau, fusionné au fluorophore EGFP. Ces cellules ont été ensemencées dans une boîte à fond de verre revêtu de conna et ensuite observées en contraste d'interférence différentielle (DIC) et en fluorescence épi.Les cellules S2 traitées par ARNi peuvent également être fixées et analysées par immunofluorescence. Ces images montrent des cellules S2 fixées, immunomarquées pour le marqueur central PLP représenté en vert et les microtubules représentés en rouge, ainsi que colorées au DAPI pour les chromosomes représentés en bleu. Avant la fixation et l'immunomarquage, les cellules ont été soumises à un traitement de quatre jours avec soit un ARNi contrôle, soit un ARNi ciblant la protéine KINESIN-like NCDA afin d'en réduire l'expression.Le traitement par ARNi NCD a donné des cellules présentant des pôles du fuseau écartés et des fuseaux désorganisés. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'être très prudent lors du perçage de trous dans les boîtes de culture. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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