Name: Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Apprenez la préparation des cellules S2 de Drosophila pour la microscopie optique en utilisant le lectine ConA. Cette méthode permet d'étudier la localisation des protéines et la biologie cellulaire avec une excellente adhésion.

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Ce travail a été soutenu en partie par le National Cancer Institute P30 CA23074, la American Cancer Society Research Grant 74-001-31 institutionnels, et l&#39;Univ. de l&#39;Arizona IG SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Pour le domaine de la biologie cellulaire, un système idéal serait peu coûteux à entretenir, facile à manipuler, et se prêtent à une variété de techniques. Cellules S2 de drosophile satisfaire à ces exigences, et donc ils sont rapidement devenus le système de choix pour un nombre croissant de cellules les laboratoires de biologie. Nous avons présenté un bref aperçu des méthodes pour préparer les cellules S2 pour la microscopie. Une vertu notable de cellules S2 est le fait qu&#39;ils...

<table><tbody><tr><td>Cellules S2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cellules S2</td><td>DGRC</td><td>numéro de stock 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cellules S2</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>milieu sans sérum</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>milieu sans sérum</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>milieu sans sérum</td></tr><tr><td>Milieu Schneider&amp;rsquo;s S2</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Ajouter 10 % (concentration finale) de FBS inactivé par la chaleur pour obtenir un milieu complet.</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inactivé par la chaleur</td></tr><tr><td>Solution antibiotique 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>contient de la pénicilline (10000 U/mL),&lt;br/&gt;de la streptomycine (10000 &amp;#x03BC;g/mL) et&lt;br/&gt;de l'amphotéricine B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavaline A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>solution à 32 %</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anhydre, qualité ACS</td></tr><tr><td>Cribles moléculaires</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>type 3A</td></tr></tbody></table>

préparation des drosophile les cellules s2 pour la microscopie optique

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Le système idéal d&#39;expérimentation serait bon marché et facile à entretenir, se prêtant à une variété de techniques, et serait soutenu par une abondante littérature et de base de données la séquence du génome. Des cultures de cellules S2 de drosophile, le produit des embryons de 20 à 24 heures dissocié ancienne 1, possèdent toutes ces propriétés. Par conséquent, les cellules S2 sont extrêmement bien adapté pour l&#39;analyse des processus cellulaires, y compris la découverte des gènes codant pour les composants moléculaires du processus ou mécanisme d&#39;intérêts. Les caractéristiques des cellules S2 qui sont les plus responsables de leur utilité sont la facilité avec laquelle ils sont maintenus, leur sensibilité exquise à double brin (ds) ARN médiée par l&#39;interférence ARN (ARNi), et leur traçabilité à la microscopie par fluorescence que ce soit en direct ou fixes cellules. Les cellules S2 peuvent être cultivés dans une variété de médias, y compris un certain nombre de bon marché, disponibles dans le commerce, entièrement défini, un milieu sans sérum 2. De plus, ils poussent de façon optimale et rapide à 21-24 ° C et peuvent être cultivées dans une variété de conteneurs. Contrairement aux cellules de mammifères, les cellules S2 ne nécessitent pas une atmosphère régulée, mais plutôt bien faire avec l&#39;air normal et peut même être maintenu dans des flacons étanches. Complétant la facilité de l&#39;ARNi dans les cellules S2 est la capacité à analyser les phénotypes facilement induite expérimentalement par phase ou la microscopie à fluorescence de cellules fixées ou vivantes. Les cellules S2 grandir dans la culture comme une seule monocouche, mais ne pas afficher l&#39;inhibition de contact. Au lieu de cela, les cellules ont tendance à croître en colonies dans les cultures denses. A faible densité, les cultures cultivées sur S2 en verre ou en culture de tissus traités en plastique sont ronds et peu-joint. Toutefois, l&#39;examen cytologique des cellules S2 peut être grandement améliorée en les incitant à aplatir en cultivant intensivement brièvement eux sur une surface revêtue de la lectine, la concanavaline A (ConA) 3. Les cellules S2 peut aussi être transfectées de façon stable avec des marqueurs marqués par fluorescence à des structures étiquette ou organites d&#39;intérêt dans les cellules vivantes ou fixées. Par conséquent, le scénario habituel pour l&#39;analyse microscopique des cellules est la suivante: d&#39;abord, les cellules S2 (qui peuvent posséder des transgènes à exprimer des marqueurs marqués) sont traitées par RNAi pour éliminer une protéine cible (s). Temps de traitement ARNi peut être ajusté pour tenir compte des différences dans les protéines turn-over cinétique et pour minimiser les traumatismes de cellules / décès si la protéine cible est importante pour la viabilité. Ensuite, les cellules traitées sont transférés dans une boîte contenant une lamelle pré-enduites de conA d&#39;induire les cellules à se répandre et bien adhérer au verre. Enfin, les cellules sont imagés avec le choix du chercheur de modes de microscopie. Les cellules S2 sont particulièrement bonnes pour les études nécessitant la visualisation prolongée des cellules vivantes, puisque ces cellules rester en bonne santé à la température ambiante et une atmosphère normale.

Drosophila Schneider (S2), les cellules sont un système de plus en plus populaire pour la découverte et l&#39;analyse fonctionnelle des gènes. Notre objectif est de décrire quelques-unes des techniques microscopiques qui rendent les cellules S2 un tel système en plus important d&#39;expérimentation.

Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

Le système expérimental idéal serait bon marché et facile à entretenir, adaptable à diverses techniques, et s'appuierait sur une littérature abondante...

L'objectif général de cette procédure est de décrire la préparation de cellules S de Drosophila pour la microscopie optique. Cela est réalisé en préparant tout d'abord des boîtes de culture à fond en verre. La deuxième étape de la procédure consiste à recouvrir le fond en verre de la lectine conval.Afin de favoriser l'adhérence et l'aplatissement des cellules S2, la troisième étape de la procédure consiste à ajouter le milieu de culture et les cellules S2 dans la boîte de culture. La dernière étape de la procédure est de fixer et d'immunomarquer les cellules S2 dans la boîte de culture.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la localisation de protéines d'intérêt marquées avec quatre fluorochromes ou par immunomarquage, respectivement par microscopie de fluorescence de cellules S deux vivantes ou fixées. Bonjour, je suis Joey Club du laboratoire de Greg Rogers, Département de biologie cellulaire et d'anatomie à l'Université de l'Arizona. Je suis John Nye, également du laboratoire Rogers.Et je suis également Dan Buster, du laboratoire de Greg Rogers. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de préparer des cellules Drosophila S2 pour l

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Préparation des Drosophile Les cellules S2 pour la microscopie optique

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