Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

L’électrofusion implique l’application de courtes impulsions électriques à haute tension sur des cellules dans un contexte proche. Dans cette vidéo, nous démontrons l’électrofusion de cellules in vitro au moyen de l’Adherence.Method modifiée. Des expériences ont été réalisées sur des cellules de mélanome de souris, BF one.

Pour l’expérience, procédez comme suit. Cultivez des cellules dans deux flacons de culture séparés jusqu’à 80 % de confluence. Séparément, ajoutez 2,1 microlitres de chaque solution mère.

10 millimolaires C-M-F-D-A ou CMRA respectivement à trois millilitres de tampon Krebs Hess dans un tube à centrifuger. Rincer deux fois les cellules avec le tampon Krebs Hess, puis insérer les solutions de chargement dans les flacons. Les solutions de chargement contiennent respectivement environ sept micromolaires C-M-F-D-D-A ou CMRA.

Incuber les cellules pendant 30 minutes dans une atmosphère contrôlée. Au cours de cette première incubation, les régions passent librement à travers les membranes cellulaires dans le cytosol où elles sont transformées en produits de réaction imprégnés d’IMP. Après cette première incubation, rincez puis incubez les cellules avec un milieu de culture pendant encore deux heures.

Les cellules sont observées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une caméra CCD refroidie dans le logiciel d’acquisition. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 548 nanomètres et choisissez une image de fluorescence de menace de filtre passe-bande appropriée des cellules chargées avec CMRA pour les cellules chargées avec C-M-F-D-A. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 492 nanomètres et choisissez un filtre passe-bande pour les yeux de trypsine d’image de fluorescence verte, et comptez les cellules dans les deux flacons et mélangez les cellules rouges et vertes dans un rapport de un à un, ajustez la concentration cellulaire à 5 millions de cellules par millilitre.

Placez une goutte de 20 microlitres de suspension cellulaire au milieu de chaque puits. Dans une plaque multi-puits de 24, incuber les cellules dans une atmosphère contrôlée pendant 20 minutes pour permettre aux cellules de se fixer légèrement à la surface du puits en monocouche et d’établir des contacts cellulaires entre elles. Placez le multipuits avec les cellules sur la platine du microscope.

Positionnez les électrodes au fond du puits et connectez-les au générateur d’impulsions Pour obtenir une électrofusion optimale et maintenir la viabilité des cellules, des paramètres adéquats d’impulsions électriques doivent être utilisés. Ces paramètres dépendent de la lignée cellulaire et doivent être déterminés lors d’expériences préliminaires. Retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec un millilitre de tampon de phosphate de potassium ISO omu à 350 microlitres de tampon de phosphate de potassium Miller afin d’induire un gonflement cellulaire.

Laissez les cellules dans un tampon hyperosmal pendant deux minutes avant d’appliquer des impulsions électriques. Des impulsions électriques doivent être appliquées lorsque les cellules sont proches de leur volume maximal. C’est-à-dire avant qu’ils ne commencent le volume réglementaire.

Diminution dans notre expérience. Un train de huit impulsions rectangulaires d’une durée de 100 microsecondes à un hertz a été appliqué. Après l’administration du pouls.

Laissez les cellules intactes pendant 10 minutes après 10 minutes. Détermination du rendement de diffusion au moyen du contraste facial et d’un microscope fluorescent. E acquérir trois images, contraste de visage, fluorescence rouge et verte à cinq champs de vision choisis au hasard.

Dans chacun, créez des images à trois canaux à partir de chaque triplet d’image dans le logiciel d’image J afin d’améliorer la qualité visuelle des images aux étapes de prétraitement peuvent être appliquées aux images d’origine, à l’arrière-plan, à la soustraction et aux améliorations de contraste avec les ensembles de paramètres par défaut. Enfin, les images à trois canaux sont composées à l’aide du plugin RGB to gray image J. Sur une telle image, le cytoplasme au repos peut être vu avec les membranes cellulaires.

Ainsi, peu de cellules peuvent facilement être déterminées dans le comptage d’images à trois canaux pour tous les trois types de cellules, rouge, verte et doublement fluorescente. Déterminez le pourcentage de cellules doublement fluorescentes en divisant le nombre de cellules doublement fluorescentes par un nombre de toutes les cellules de chaque image. Le rendement de fusion est alors défini comme le pourcentage de cellules doublement fluorescentes multiplié par deux.

Étant donné que la moitié des cellules de vue ne sont pas détectées lorsque les cellules des mêmes vues de couleur.