Photoconversion de protéines purifiées fluorescentes et double-sonde optique dans Soulignant cellules vivantes

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser les protéines fluorescentes M orange deux etron comme sondes doubles pour la mise en évidence optique, afin de marquer de façon sélective quatre populations cellulaires individuelles ou compartiments cellulaires. Cette approche consiste, dans un premier temps, à illuminer les cellules avec une lumière d'excitation de faible intensité à 488 nanomètres pour éteindre toute la fluorescence verte émise par le drawn per. Dans un deuxième temps, les cellules sont exposées à une lumière d'excitation à 488 nanomètres de forte intensité, qui convertit photochimiquement la fluorescence de M orange en rouge.

Ensuite, les cellules sont exposées à une excitation à deux photons de 800 nanomètres afin d'activer la fluorescence de dral. Là encore, les résultats obtenus montrent qu'il est possible de marquer les cellules selon quatre combinaisons distinctes, basées sur une mise en évidence optique double avec M Orange deux et drawn ppa. Le principal avantage de cette procédure par rapport aux expériences existantes, comme la fractionnement subcellulaire, est qu'elle est réalisée sur des cellules vivantes.

Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés en biologie des cellules bêta, comme pourquoi seule une petite fraction des vésicules d'insuline est sécrétée. Bien que cette procédure permette d'obtenir des informations sur la fonction des cellules bêta, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes. Par exemple, le suivi de cellules cancéreuses in vivo, un échantillon de gouttelettes de protéine fluorescente consiste en une émulsion aqueuse octale contenant une protéine fluorescente présente dans la phase aqueuse.

Cette émulsion est placée entre une lame de microscope et un couvre-objet carré de 22 millimètres pour des applications de microscopie. Au début de cette procédure, les lames et les couvre-objets doivent être nettoyés et recouverts d'un agent hydrophobe. Nettoyez le matériel en verre en le lavant pendant cinq minutes avec de l'acétone.

Après le lavage, laissez sécher le matériel de verre à l'air. Ensuite, préparez une solution de sélène triméthoxy méthyl à 2 % dans l'acétone et trempez le matériel de verre dans cette solution pendant deux minutes. Après le revêtement, retirez le matériel de verre de la solution et laissez-le sécher.

Ensuite, rincez la verrerie avec de l'éthanol à 70 % provenant d'un flacon pulvérisateur. Après le rinçage, laissez la verrerie sécher à l'air une fois de plus et éliminez tout liquide résiduel. À l'aide d'air comprimé, la verrerie revêtue peut être conservée pendant au moins un mois.

Une fois que la verrerie a été préparée, obtenez les protéines fluorescentes qui ont été précédemment purifiées sous forme de protéine marquée par une histidine à partir d’e. coli. Mesurez le spectre d’absorption de la protéine purifiée. Préparez une dilution mère ayant une densité optique d’environ 0,1 dans une solution tamponnée au tris de pH huit contenant 0,1 % d’albumine de sérum bovin.

En outre, préparez 10 millilitres d'un mélange un pour un d'octal et de solution saline tamponnée au tris dans un tube conique de 15 millilitres et mélangez vigoureusement. Après le mélange, laissez reposer le mélange jusqu'à ce que la séparation des phases soit complète. La phase supérieure est l'octal ; pour préparer l'émulsion, pipetez 45 microlitres d'octal et 5 microlitres de protéine fluorescente dans un tube epi orph.

Tapotez le tube plusieurs fois pour amorcer la formation de l'émulsion, puis soumettez le tube à une sonication pendant 30 secondes dans un bain à ultrasons. Pendant ce temps, préparez une lame de microscope revêtue et un couvre-objet en vue de la sonication. L'émulsion doit être complètement trouble.

Prélève immédiatement quatre microlitres de l'émulsion au milieu du tube à l’aide d’une pipette et dépose-les sur une lame de microscope recouverte, puis couvre avec un couvre-objet recouvert. L’émulsion doit s’étaler uniformément entre la lame et le couvre-objet. En quelques minutes, l’échantillon doit devenir stable.

La procédure suivante constitue une stratégie générale pour la mise en place d'une expérience de photoconversion de protéines fluorescentes sur un microscope confocal à balayage laser. Cette procédure peut être appliquée à des protéines purifiées ainsi qu'à des cellules vivantes. Dans cette expérience, un échantillon en goutte contenant la protéine purifiée m orange two est utilisée comme point de départ général pour l'expérience de photoconversion.

Configurer le microscope à balayage laser confocal comme suit. Utiliser un objectif à immersion dans l'huile de 40 x 1,3 d'ouverture numérique et une taille d'image de 512 par 512 pixels. Régler le temps de séjour par pixel à six microsecondes, le zoom à quatre et augmenter la taille du diaphragme pour obtenir une résolution Z de trois micromètres.

Configurez deux canaux de détection pour la fluorescence initiale et la fluorescence après conversion photochimique, ainsi qu'un canal de conversion photochimique. Observez les espèces oranges à l'aide d'une lumière d'excitation de 561 nanomètres et collectez la fluorescence entre 570 et 630 nanomètres. Détectez les espèces rouges après conversion photochimique en utilisant une lumière d'excitation de 633 nanomètres et collectez la fluorescence entre 640 et 700 nanomètres.

Pour le canal de conversion photochimique, sélectionnez la ligne laser de 488 nanomètres et collectez la fluorescence entre 490 et 540 nanomètres. Imagerie. Le canal de conversion photochimique n'est pas strictement nécessaire, mais peut s'avérer utile. Pour commencer l'expérience, utilisez le canal du détecteur pour imager la fluorescence initiale en balayage continu afin d'ajuster la puissance du laser et le gain du détecteur pour une qualité d'image optimale.

Ensuite, activez le canal de conversion photochimique et sélectionnez une faible puissance laser. Commencez l'acquisition d'une série en laps de temps et augmentez progressivement le laser de conversion photochimique jusqu'à ce qu'un blanchiment significatif de la fluorescence initiale soit observé. Poursuivez la numérisation jusqu'à ce que la fluorescence initiale soit environ à 75 % blanchie.

Ensuite, désactivez le canal de conversion photochimique et activez le canal de détection de la fluorescence photoconvertie. Commencez l'acquisition avec un gain du détecteur élevé et une faible puissance laser. Augmentez ensuite progressivement la puissance laser jusqu'à ce que la fluorescence photoconvertie soit détectée.

Une fois détecté, ajustez la puissance du laser et la détection ou le gain pour obtenir une qualité d'image optimale. Enfin, optimisez la puissance du laser utilisée pour la photoconversion ainsi que sa durée. L'augmentation de la puissance du laser accélérera la vitesse de photoconversion.

Cependant, une puissance laser trop élevée entraînera un photoblanchiment de la protéine. Une fois que la conversion photochimique optimale, la puissance laser et la durée ont été déterminées, ces paramètres peuvent être utilisés pour configurer un module standard de photoblanchiment ou un module de récupération de la fluorescence après photoblanchiment. Le canal de conversion photochimique ne sera alors plus nécessaire en raison des propriétés spectrales de décalage vers le rouge de M orange two.

Il peut être utilisé en combinaison avec la protéine fluorescente photoswitchable verte appelée Dronpa pour une marquage optique double sonde. Pour commencer le marquage optique double sonde, cultiver des cellules HeLa dans des boîtes en verre avec fond MatTek. Transfecter les cellules avec des plasmides codant pour les protéines fluorescentes 24 heures avant l’imagerie, en utilisant une transfection standard avec LIPECTOMY 2000.

Placer les cellules vivantes sur un microscope à balayage laser confocal et configurer le microscope pour la conversion photo à deux photons de M orange comme décrit précédemment. Ensuite, régler le microscope pour la commutation photo de DPA. DPA est excité par une lumière de 488 nanomètres et sa fluorescence peut être imagée en utilisant le canal de conversion photo à deux photons de M orange.

Veillez à minimiser la puissance laser utilisée pour l'imagerie de MPA, car une puissance laser excessive entraînera l'inactivation de mpa. Ajoutez un canal pour l'activation photochimique de MPA en utilisant une excitation à deux photons à 800 nanomètres, puis déterminez la puissance laser nécessaire pour l'imagerie, l'activation photochimique et l'inactivation photochimique de la fluorescence OFA.

L'un des aspects les plus difficiles de cette procédure consiste à inactiver la RPA sans photoconvertir M orange, car ces deux événements se produisent à la même longueur d'onde. Pour éviter cela, il est très important d'optimiser soigneusement la photoconversion.

Puissance et durée du laser : faites preuve de prudence en cas de photoconversion de M orange deux. Une inactivation de PU se produit simultanément lors de l'excitation avec une lumière de 488 nanomètres, permettant d'inactiver PU sans provoquer une photoconversion significative de M orange deux. Utilisez une puissance laser plus faible une fois les paramètres de photoconversion de M orange deux et de commutation photo de DPA définis.

Une mise en évidence optique à double sonde peut être réalisée. Commencez par inactiver la fluorescence du DPA sur tout le champ d'observation à l'aide d'une excitation à faible puissance à 488 nanomètres. Ensuite, sélectionnez une région d'intérêt et convertissez la m orange deux par une excitation à 488 nanomètres de haute puissance.

Enfin, sélectionnez une région d'intérêt et activez la fluorescence de la DPA à l'aide d'une excitation biphotonique à 800 nanomètres. Les échantillons de gouttelettes de protéines fluorescentes sont idéalement adaptés à la mise en place d'applications de photoconversion en microscopie confocale. Lorsque l'échantillon de gouttelettes est correctement préparé, les gouttelettes apparaissent très homogènes.

Cependant, lorsque l'échantillon est préparé sans enrober la lame de microscope avec un couvre-objet, les gouttelettes ont tendance à être écrasées contre l'une des surfaces en verre dans les échantillons préparés. En l'absence de BSA à 0,1 %, la protéine fluorescente a tendance à s'accumuler à l'interface eau-octanol. La création d'un halo de fluorescence par photoconversion dépend de manière critique de la puissance du laser et de la durée d'exposition.

Une puissance laser trop élevée ou une exposition trop longue provoquera un photoblanchiment et entraînera une réduction de la fluorescence rouge photo-convertie. Les propriétés spectrales distinctes de M orange deux et de PHO permettent une mise en évidence optique double avant la photoconversion. Les cellules exprimant M orange deux, l'histone H deux B et DPA mito présentent une fluorescence orange dans le noyau et une fluorescence verte dans les mitochondries. Lorsque toute fluorescence est éteinte par une excitation à faible puissance à 488 nanomètres, la photoconversion de M orange est minimale.

Deux M orange deux peuvent ensuite être photoconvertis en rouge à l'aide d'une excitation à 488 nanomètres de haute puissance. Une fois que M orange deux a été photoconverti, la fluorescence du nuage peut être réactivée par une excitation à deux photons à 800 nanomètres. Grâce à la mise en évidence optique à double sonde, les cellules peuvent être marquées de quatre manières distinctes.

Grâce à cette technique, il est possible de marquer spécifiquement quatre populations cellulaires différentes. Comme vous l'avez vu, l'un des aspects les plus délicats de cette procédure consiste à inactiver le MPA sans photoconvertir la mOrange. Une fois maîtrisée, d'autres expériences peuvent être réalisées à l'aide de ce système, par exemple le suivi de multiples populations dans les cellules bêta pancréatiques.

Voilà donc tout ce qu'il y a à dire. J'espère que cette présentation vous a été utile, et bonne chance dans vos expériences.