Techniques d'imagerie Ca ^{2 +} Signalisation dans le sperme humain

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des séries d'images à partir de spermatozoïdes humains immobilisés marqués avec un colorant fluorescent rapporteur du calcium. Tout d'abord, les cellules mobiles sont isolées du plasma séminal par une remontée active dans le milieu d'incubation. Après la capacitation, les cellules sont marquées avec un indicateur fluorescent du calcium, puis transférées dans une chambre d'imagerie fusible, qui est montée sur un microscope à fluorescence inversé.

Les réponses de concentration en ions calcium sont capturées sous forme de séries d'images en accéléré et analysées afin d'extraire les réponses au niveau cellulaire individuel. Bonjour, je suis Edwin Andres Morales Garcia du laboratoire du Dr Steven J. Public Cova à l'École des biosciences de l'Université de Birmingham au Royaume-Uni. Je suis Katherine Nash, également membre du Public Overlap.

Et je suis Jennifer Morris du Public Overlap. Aujourd'hui, nous allons vous montrer le protocole d'imagerie des réponses calciques intracellulaires chez des spermatozoïdes humains individuels. Nous utilisons ce protocole dans notre laboratoire pour étudier la régulation des activités des spermatozoïdes à l'aide de stimuli dérivés de l'ovule et du tractus femelle.

Commençons donc. Conservez les échantillons de sperme à 37 degrés Celsius pendant pas plus de 30 minutes à compter du prélèvement, afin d'isoler les cellules motrices du plasma séminal. Ajoutez un millilitre de solution saline équilibrée L'S enrichie avec 0,3 % de BSA, abrégée en S-E-B-S-S, dans une série de tubes en polystyrène de cinq millilitres à fond rond. Superposez délicatement le S-E-B-S-S dans chaque tube avec 0,3 millilitre de sperme et fermez le tube légèrement.

Incuber les tubes à un angle de 45 degrés pendant une heure à 37 degrés Celsius et 6 % de dioxyde de carbone. Pour permettre aux cellules mobiles de remonter dans le S-E-B-S-S, prélever délicatement par pipetage les 0,7 millilitre supérieurs de la solution et transférer la solution provenant de tous les tubes dans un tube de centrifugation en polystyrène propre de 15 millilitres. Agiter doucement pour mélanger, puis compter les cellules qui ont été immobilisées avec du formol dans une nouvelle chambre de comptage.

Amener la concentration à 6 millions de cellules par millilitre dans le milieu S-E-B-S-S et répartir le sperme en aliquots de 200 microlitres dans des tubes coniques en polystyrène de 5 millilitres. Fermer les bouchons légèrement. Si l'on étudie la réponse de cellules capacitées, incuber les tubes pendant cinq à six heures à 37 degrés Celsius et 6 % de dioxyde de carbone afin de permettre la capacitation. Appliquer 10 microlitres de polylysine à 10 % sous forme de plusieurs petites gouttes au centre d'une lame de 22 par 50 millimètres.

Couvrir le numéro un avec un coverslip et laisser sécher complètement. Utiliser de la graisse à vide pour fixer le coverslip, côté traité vers le haut, sur une chambre d'imagerie fusible préparée. À cet effet.

Pour chaque expérience d'imagerie, sélectionnez un seul tube de cellules capacités et ajoutez 1,2 microlitre de 2,5 milligrammes par millilitre. Organ green dépendant du calcium dissous dans le DMSO pour une concentration finale de 10 micromolaire. Incubez le tube pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius et 6 % de dioxyde de carbone.

À l’aide d’un micropipeteur de 200 microlitres Pepto muni d’une pointe P 200, retirez complètement toute la solution du tube. Remplissez la chambre en injectant doucement par le port d’entrée. Inclinez la chambre afin que les bulles s’échappent par le port de sortie.

Placer l'ensemble de la chambre dans l'incubateur et incuber pendant encore 20 minutes à 37 degrés Celsius et 6 % de dioxyde de carbone. Pour permettre aux spermatozoïdes d'adhérer à la poly-D-lysine. Monter la chambre sur le microscope à fluorescence inversé et la connecter à l'appareil de perfusion.

Laisser la préparation à l'obscurité pendant au moins 10 minutes afin de permettre l'élimination de la perfusion. Observer au contraste de phase à un grossissement de 40 x ou 60 x pour repérer les cellules détachées et les débris extracellulaires ; choisir un champ dans lequel l'espacement entre les cellules est suffisant pour permettre d'évaluer séparément la fluorescence de chaque cellule. Les cellules doivent être correctement fixées, mais il est préférable qu'elles présentent une activité de bourgeonnement clairement visible.

Passer au canal de fluorescence verte. Maintenir les temps d'exposition au minimum nécessaire pour obtenir une image fluorescente nette. Afin de réduire la photodégradation dans le logiciel IQ.

Activez l'acquisition d'images en série temporelle. Acquérez des images à 0,1 hertz et utilisez un obturateur commandé par logiciel pour limiter l'illumination. Après un enregistrement initial pendant une période de contrôle de trois à cinq minutes, modifiez la concentration en calcium du liquide de perfusion et appliquez les médicaments en changeant le liquide au niveau de l'entrée du système de perfusion.

Notez l'heure à laquelle chaque stimulus est ajouté à l'en-tête et calculez son temps d'arrivée dans la chambre, comme décrit dans la partie écrite de ce protocole. Pour analyser les images hors ligne, utilisez l'un des outils de dessin afin de délimiter une région d'intérêt ou ROI autour de chaque cellule ou partie de cellule ici, la tête postérieure du spermatozoïde, car le calcium stocké est mobilisé dans cette zone. Faites défiler à l'aide de la barre de défilement pour consulter la série d'images.

Identifier et supprimer les cellules qui ne restent pas entièrement dans la zone d'intérêt (ROI), chevauchent d'autres cellules ou présentent une augmentation importante et rapide suivie d'une chute nette de l'intensité de fluorescence, caractéristique de la mort cellulaire. Utiliser la fonction d'analyse pour générer une série temporelle de l'intensité de fluorescence pour chaque ROI. Les données peuvent ensuite être exportées et analysées dans un tableur.

Ces images proviennent d'une série obtenue pendant une stimulation avec trois micromoles de progestérone. La rangée inférieure a été recouverte d'une fausse couleur. Pour mieux illustrer les changements d'intensité relative, la progestérone est entrée dans la chambre ici.Ici.

Ces résultats sont animés dans une vidéo accélérée. Observez la brusque augmentation de l'intensité de fluorescence suivie d'une augmentation lente, indiquant des variations correspondantes des concentrations intracellulaires de calcium. Ces données sont quantifiées ici à partir des intensités moyennes de la région postérieure de la tête de trois cellules.

Trois micromoles de progestérone ont été ajoutés au moment indiqué par la flèche. La ligne pointillée représente la fluorescence moyenne du témoin. Aujourd'hui, nous venons de vous montrer comment isoler des cellules de bonne qualité, les charger avec un colorant sensible au calcium, et suivre la réponse de cellules individuelles à une stimulation.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser la population cellulaire la plus adaptée, de minimiser l'illumination des cellules afin d'éviter les dommages photo-induits et de choisir le colorant qui convient le mieux aux réponses que vous souhaitez observer. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.