Name: Cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Découvrez la préparation de cultures neuronales primaires à partir de cerveaux de pupes tardives de Drosophila. Cette méthode permet d'étudier la croissance des neurites et la dynamique calcique par imagerie Fura-2.

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Ce travail a été soutenu par le NIH aux subventions NS27501 DKOD. Un appui supplémentaire pour ce travail a été fourni par une subvention à l&#39;UC Irvine en faveur de DKOD l&#39;entremise du Programme Professeur HHMI.

Les préparatifs avant le jour de la culture: <ol><li> Faire une solution stérile de dissection. </li><li> Faire stériles DMEM et garder en aliquotes de 10 ml à 4 ° C pendant 2 semaines. </li><li> Faire stériles DDM2 suppléments et geler en 50 ou 100 aliquotes pendant 1 mois. </li><li> Faire ConA / laminine. </li><li> Manteau lamelles. Optionnel: Faire CNBM stériles et conserver au congélateur jusqu&#39;à quatre mois. </li></ol> Le jour de la culture I. Préparer la solution enzymatique (ES) en hotte à flux laminaire <ol><li> Mettre 5 ml de solution de dissection (DS) dans un tube à centrifuger de 15 ml. </li><li> Peser à 0,8 mg de L-cystéine dans un eppendorf de 0,6 ml et ajouter 150 ul de la DS. Pipeter haut en bas jusqu&#39;à cristaux ont disparu. </li><li> Ajouter 150 ml de DS / cystéine dans les 5 ml DS et bien mélanger. </li><li> Ajouter 50 U (unités) de la papaïne. </li><li> Ajouter 7 ml de 0,1 N Na OH et bien mélanger. Solution sera clair dans les 30 min. lorsqu&#39;il est activé. </li><li> Solution enzymatique filtre avec filtre seringue 0,2 mm dans un tube de 1,5 à vis stériles ml microcentrifugeuse bouchon Papaïne: Voulez-vous 50 U dans DS 5 ml. Chaque lot est légèrement différente, donc faut calculer combien: 37,3 mg / ml et 28,3 U / mg 37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml) 50 U = 47,4 ml </li></ol> II. Faire DDM2 des médias Le jour de la culture: ajouter les suppléments suivants pour faire DDM2 A 10 ml de DMEM ajouter les suppléments, juste avant la culture: <ol><li> 100 ul de la transferrine </li><li> 100 ul Putrescine </li><li> 100 ul Sélénium </li><li> La progestérone 100 ul </li><li> Insuline 50 pl </li><li> 10 ul 20 Hydroxyecdysone </li></ol> Remarque: Assurez assez DDM2 pour toutes les cultures prévues (chaque cerveau plaqué sur une lamelle unique dans un plat individuel de 35 mm de Pétri, 1,5 ms de média / culture) Etape III-VI peut être à une table de laboratoire non stériles fait et devrait être terminé en 45 minutes ou moins. III. Les chrysalides Collection <ol><li> Sélectionnez 10-15 pupes des côtés du flacon sous un microscope à dissection. </li><li> Pupes place dans le couvercle d&#39;une boîte de Pétri de 35 mm à sec. </li></ol> Note: Nous utilisons généralement le cerveau à partir de pupes entre 55-78 heures après la formation puparium (CSA). Il est légèrement plus difficile à disséquer le cerveau de la jeune nymphe depuis le capsules céphaliques ont tendance à s&#39;effondrer, tandis que le niveau global de la croissance des neurites est légèrement inférieure de la plus ancienne des pupes. Dans la souche Canton-S de type sauvage, ces étapes sont reconnus par les yeux qui sont pigmentées brun clair à légèrement rougeâtre, avec des pigments peu ailleurs. IV. Décapitation au microscope disséquant <ol><li> Placez deux gouttes de solution de dissection stériles dans le couvercle de la boîte de Pétri, à côté de pupes. </li><li> Maintenez une seule nymphe avec une pince fine dans la main gauche et l&#39;utilisation d&#39;une aiguille de calibre 27 seringue fixée à une seringue de 1 cc dans la main droite pour enlever la cuticule à l&#39;extrémité antérieure de la chrysalide. </li><li> Presser légèrement avec une pince nymphe et en tant que tête émerge utilisez une aiguille de calibre 27 pour couper le cou. </li><li> Avec la pointe de l&#39;aiguille ou la pince, le transfert à la tête goutte de dissection solution. </li><li> Répétez jusqu&#39;à ce que vous avez de 10 à 15 têtes dans une seule goutte. </li></ol> Retrait V. le cerveau de la tête sous loupe binoculaire <ol><li> Dans chaque main tenir une seringue de 1 cc avec une aiguille de calibre 27. </li><li> Utilisez-les pour positionner la tête de volée dans la goutte de dissection solution si la trompe est tournée vers vous et la surface dorsale de la tête est au nord. </li><li> Insérez l&#39;aiguille à gauche dans la trompe à la broche de la tête en bas et utilisez l&#39;aiguille de droite pour faire une fente dans l&#39;œil droit qui va de la ventrale à la surface dorsale. </li><li> Insérez l&#39;aiguille droite près de la gauche dans la région de la trompe, puis utilisez l&#39;aiguille de gauche à enfoncer délicatement la cuticule sur l&#39;oeil gauche, pousser le cerveau vers la fente de l&#39;oeil droit. Le cerveau doit sortir de la fente sur la droite, relativement intacte, souvent avec deux optiques lobes encore attaché et parfois les tissus oculaires pigmentés ainsi. </li><li> Poussez le cerveau sur le dos de l&#39;aiguille et le transfert d&#39;une goutte de solution saline stérile dans la dissection d&#39;un nouveau stérile, plat de 35 mm de Pétri. </li><li> Recueillir 10-15 cerveaux pour chaque génotype. </li></ol> VI. Suppression des lobes optiques et un traitement enzymatique <ol><li> Dans chaque main tenir une seringue de 1 cc avec une aiguille de calibre 27 et de les employer pour recueillir tous les cerveaux dans une petite zone de la goutte de solution de dissection </li><li> Utiliser des seringues que les outils de coupe pour enlever les lobes optiques de chaque cerveau de sorte que le tissu restant de la culture est la région du cerveau central. </li><li> Utilisez un Pipetman 20 pl, fixé à 5 pl, pour transférer tous les cerveaux d&#39;un génotype unique à un tube Eppendorf contenant 1 ml de solution de papaïne stérile. </li><li> Cerveaux incubés dans la papaïne pendant 10-15 minutes sur un rotateur réglé à 60 rpm. </li><li> Centrifuger à 3000 rpm pendant 3 minutes. </li></ol> A l&#39;intérieur capuche à flux laminaire stérile - toutes les étapes où le tissu est exposé à l&#39;air doit être fait dans une hotte à flux laminaire pour les étapes restantes. VII. Lavage <ol><li> Retirer et remplacer la solution d&#39;enzyme avec une solution stérile de dissection. </li><li> Centrifuger à 3000 rpm pendant 3 minutes. </li><li> Laver avec une solution stérile de disséquer un total de 3 fois. </li><li> Retirer salines dissection et la remplacer par DDM2. </li><li> Centrifuger et laver un total de 2 fois avec DDM2. </li><li> Transfert des cerveaux et des médias dans un plat stériles de 35 mm de Pétri. </li></ol> VIII. Trituration et de placage sous loupe binoculaire <ol><li> Placer 5 ul d&#39;DDM2 dans le centre d&#39;une lamelle. </li><li> Transférer 1 cerveau pour cette goutte d&#39;DDM2 avec une pointe de jaune. </li><li> Sous le microscope, l&#39;utilisation d&#39;aiguilles de calibre 27 à la place du cerveau dés en petits morceaux (devrait prendre &lt;1 minute). </li><li> Sous guidage visuel, casser la pointe d&#39;une pipette en verre qui a été tirée en une fine pointe de sorte que les plus gros morceaux peuvent être doucement aspiré dans la pointe de la pipette et expulsés de nouveau dans le milieu. Nous utilisons des tubes d&#39;aspiration bouche qui sont livrés en standard avec 100 ul de verre hématocrite capillaire. Remarque: Prenez soin de ne pas obtenir des bulles dans les médias et vous aurez besoin de déterminer empiriquement la pipette meilleure taille à utiliser. Les bons vous permettent de dissocier le cerveau avec des cellules individuelles et encore quelques grosses touffes, en environ 30 secondes / cerveau. Lorsque vous regardez ces à haute puissance, environ 10-20% des neurones devrait encore avoir quelques procédés restants et il y aura encore quelques grosses touffes. Si vous dissocier trop, alors toutes les cellules seront rondes et ils ont subi des dommages tant qu&#39;ils ne seront pas survivre. Cette étape nécessite de la pratique et doit être fait rapidement car il ya une grande surface à volume élevé et de l&#39;osmolalité et le pH de la goutte d&#39;DDM2 peuvent changer rapidement. Tissus doit être placé dans incubateur à CO 2 aussi vite que possible. </li><li> Écrire sur le couvercle boîte de Pétri: «génotype, la date et l&#39;heure&quot;. </li><li> Mettez la boîte de Petri de 35 mm dans un plat de Pétri de 100 mm (avec Kimwipe humide) et laissez s&#39;installer dans l&#39;incubateur CO 2 pendant 30 min. </li><li> Recouvrir le plat de 35 mm avec 1,5 ml de DDM2. </li><li> Gardez les cultures dans l&#39;incubateur à 5% de CO 2 incubateur (23 ° C). Remarque: Si vous n&#39;avez pas accès à un refroidissement incubateur à CO 2, utiliser une norme de mammifères incubateur de culture tissulaire et soit le mettre dans une pièce fraîche et chauffer à 23 ° C, ou mis dans le laboratoire, éteignez temp, et l&#39;utilisation glace dans un bac en bas de l&#39;incubateur pour réguler température ambiante autour. </li></ol> IX. Cellules nourricières <ol><li> Le Jour 1 (le lendemain), ajoutez 0,5 ml de CNBM/B27 (milieux conditionnés) de faire DDM2 03h01: CNBM/B27. </li><li> Le Jour 5 remplacer 1 ml de médias pour 03h01 DDM2: CNBM/B27. </li><li> Gardez les cellules d&#39;alimentation avec 3:01 DDM2: CNBM/B27 tous les 4-5 jours. Note: Les cultures peuvent être cultivées sans que les médias non-neuronales conditionné mais les neurones apparaissent un peu plus fragiles et sont plus difficiles à utiliser dans des expériences d&#39;électrophysiologie. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
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<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

Neurones récoltés à partir de cerveaux de rongeurs embryonnaire / postnatale peut être cultivé en culture cellulaire primaire, où elles s&#39;étendent neurites et la forme fonctionnelle des connexions synaptiques. Méthodes de préparation de ces cultures sont bien établies et d&#39;études dans les cultures neuronales de rongeurs ont joué un rôle crucial dans l&#39;identification des gènes et des facteurs environnementaux impliqués dans la régulation de la formation des synapses et de la fonction (Banker et Goslin, 1991). Alors que les neuron...

Lamelles de revêtement: Mettre des lamelles autoclavés dans un plat de Pétri de 60 mm. Pipeter 5 ul de Con A mix / laminine au centre de chaque lamelle. Placer dans 37 C incubateur pendant 2 heures. Rincez lamelles 3x avec 100 ul d&#39;eau autoclavée chacun. Utilisez l&#39;aspirateur attaché à une pipette Pasteur stérile. Au cours du dernier rinçage, ramasser la lamelle avec une pince et sec des deux côtés. Transférer la lamelle d&#39;un plat de Pétri de 35mm. Stocker à température ambiante pendant jusqu&#39;à un mois.

cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation des cultures primaires de neurones du cerveau des drosophiles stade avancé pupes. La procédure commence par l&#39;enlèvement des cerveaux des animaux à 70-78 heures après la formation puparium. Les cerveaux isolés sont présentés après une brève incubation de la papaïne suivie de plusieurs lavages en milieu de croissance sans sérum. Le processus de dissociation mécanique de chaque cerveau dans une baisse de 5 ul des médias sur une lamelle est illustré. Les axones et des dendrites des neurones post-mitotiques sont fait une embardée hors près du soma au cours de dissociation, mais les neurones commencent à se régénérer les processus au sein de quelques heures de placage. Les images montrent des cultures vivantes moins 2 jours. Neurones continuer à élaborer des processus pendant la première semaine de la culture. Populations neuronales spécifiques peuvent être identifiées en culture en utilisant GAL4 lignes pour conduire l&#39;expression tissu spécifique de marqueurs fluorescents tels que la GFP ou DP. Enregistrements de cellules entières ont démontré les neurones cultivés forme fonctionnelle, spontanément actifs synapses cholinergiques et GABAergiques. Un segment courte vidéo illustre la dynamique du calcium dans les neurones cultivés en utilisant Fura-2 comme un colorant indicateur de calcium pour contrôler transitoires calciques spontanées et la nicotine réponses de calcium évoquée dans un plat de neurones en culture. Ces cultures du cerveau pupe sont un système modèle utile dans lesquels des outils génétiques et pharmacologiques peuvent être utilisés pour identifier les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui influencent la formation et la fonction des synapses centrales.

Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones du cerveau des drosophiles stade avancé pupes. Vues des cultures vivantes montrent neurites et l&#39;imagerie des niveaux de calcium en utilisant Fura-2.

Cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes

Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation de cultures neuronales primaires à partir du cerveau de nymphes de Drosophila à un stade avancé. La procédure commence par le...

Je m'appelle Diana Dowd et je suis professeure dans les départements d'anatomie et de neurobiologie, ainsi que de biologie du développement et cellulaire ici à l'université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais vous parler de la préparation de cultures neuronales à partir de puces de Drosophila. Cette méthode consiste à extraire le cerveau de puces au stade tardif, et nous mettons généralement en culture uniquement la région du cerveau central.À ce stade, les principales structures anatomiques présentes dans le cerveau adulte sont déjà formées. Cela inclut les lobes antennaires, où se trouvent des neurones projeteurs qui envoient leurs axones jusqu'à la région du corps en crochets, ainsi que les neurones du corps en crochets, les cellules de Kenyon, qui ont envoyé leurs axones vers leurs neurones cibles à travers les lobes alpha, bêta et gamma. Le jour de la culture, la première chose que nous faisons est d'entrer dans la hotte à flux laminaire et de préparer, de manière stérile, la solution enzymatique que nous allons utiliser pour dissocier le tissu.Nous préparons également le milieu que nous allons utiliser pour la culture des cellules. Ce milieu est fabriqué à partir de tiges que nous avons préparées à l’avance. L’étape suivante consiste à recueillir les pupes que nous allons utiliser pour cette dissociation ou pour la dissection.Et cela se fait à l'extérieur de la hotte, car ces échantillons sont cultivés dans des vials contenant de la levure et toutes sortes d'autres éléments. Nous effectuons donc les étapes initiales de notre dissection à l'extérieur de la hotte. Ce sont des peepee que je viens de prélever sur les parois d'un vial, et sur cette rangée de gauche, nous avons des animaux aux yeux rouges, qui sont à un bon stade pour la culture.Ceux-ci sont légèrement plus jeunes, ces PPP-ci sont légèrement plus jeunes. Ils ont des yeux orange ou jaunes, et il s'agit d'une lignée 1 0 7 acceptable. Leurs yeux sont légèrement plus clairs que ceux des types sauvages ordinaires, dont la couleur à ces stades serait un peu plus brune.Toutes ces étapes conviennent bien pour la culture, afin de réaliser les cultures cérébrales. Bon, la première étape consiste à déposer quelques gouttes de solution de dissection juste à côté des pupes que j'ai extraites et alignées dans ma boîte de Pétri. Nous utilisons les couvercles de boîtes de Pétri de 35 millimètres.Je prends ensuite une paire de forceps n°5 dans ma main gauche et une seringue tuberculinique de 1 cc munie d'une aiguille de calibre 27 à l'extrémité. Ce sont mes deux outils de dissection. Pour retirer la tête de l'écaille pupillaire ou du pupi, je dois essentiellement utiliser l'i : je tiens le pupi avec mes forceps dans la main gauche, puis j'utilise l'aiguille dans la main droite pour enlever la partie avant de l'écaille pupillaire.Je repousse ensuite la cuticule recouvrante et la tête émerge à l'avant. J'utilise alors mon aiguille pour sectionner l'animal au niveau de la région du cou, puis je prends la tête et la place dans la goutte de solution saline de dissection. Je répète cette procédure 10 à 15 fois, car pour obtenir une bonne culture, j'aime disposer de 10 à 15 individus de chaque génotype.Très bien, je vais retirer le cerveau de la tête de l'animal. Pour ce faire, j'utilise deux seringues tuberculiniques, chacune équipée d'une aiguille de calibre 27. J'insère l'aiguille gauche directement à travers le psis de l'animal afin d'immobiliser la tête sur le fond de la boîte de Pétri.Ensuite, j'utilise mon aiguille droite pour ouvrir une fente sur le côté droit, et c'est par là que je vais faire sortir le cerveau. Très bien, l'étape suivante consiste alors à placer mon aiguille gauche au-dessus de l'œil gauche. Maintenant, je vais simplement pousser vers l'extérieur (ex-pousser) et le cerveau doit sortir du côté droit à travers la fente.La voilà. Vous pouvez la voir sur le côté droit, et maintenant je peux simplement utiliser mon aiguille droite pour la séparer du reste de la capsule céphalique et des yeux. Très bien. Maintenant, avant d'effectuer la dissection finale, qui consiste à retirer les lobes optiques, je transfère le cerveau dans une goutte propre de solution saline.Je peux utiliser une pipette automatique pour cela, et je prélève la goutte à l'extrémité même d'une pipette de 20 microlitres, que je règle à cinq microlitres, ou je peux effectivement aussi la transférer à l'aide des aiguilles. C'est la dernière étape de la procédure de dissection. Elle est réalisée dans une goutte fraîche de solution saline, et généralement, j'ai environ 10 à 15 cerveaux ici.Je retire ensuite les lobes optiques de chacun à l'aide d'aiguilles de calibre 27 servant d'outils de coupe, en sectionnant d'abord le lobe optique gauche, puis le lobe optique droit de chaque cerveau. À ce stade, tous les cerveaux ainsi traités sont transférés dans un tube contenant la solution enzymatique, qui sera utilisée pour la dissociation enzymatique. Tous les cerveaux provenant d'un même génotype sont placés dans un seul tube Eppendorf à vis avec bouchon fileté contenant un millilitre de solution enzymatique.Ensuite, nous les plaçons simplement dans un support pour tubes à essai et les mettons sur un rotateur, où ils restent 10 à 15 minutes à température ambiante. C'est la durée réelle de la dissociation. Pour terminer l'étape de dissociation enzymatique, nous devons effectivement éliminer l'enzyme.Nous transportons donc les tubes vers une centrifugeuse EOR, plaçons les tubes dans la centrifugeuse et les centrifugeons pendant trois minutes à 3000 tr/min. Après avoir centrifugé les cerveaux, nous les apportons maintenant dans notre hotte à flux laminaire. C'est à ce moment que commence la partie stérile de la procédure.Nous n'ouvrons plus le tube sauf lorsque nous sommes dans la hotte à flux laminaire, et nous allons maintenant éliminer la solution enzymatique. Nous la remplacerons par la solution de dissection, puis nous effectuerons plusieurs centrifugations et lavages avec la solution de dissection, pour terminer avec un milieu défini, qui est le milieu dans lequel nous cultivons les cellules. Très bien.La première chose que je dois faire ici est de déposer une goutte de cinq microlitres de solution saline sur chacun des lamelles que j'ai placées dans ces boîtes de Pétri. Il y a une seule lamelle par boîte de Pétri, et elle a été recouverte de con A laminine ; j'ajoute donc une goutte de cinq microlitres directement au centre de la lamelle. C'est à cet endroit que se trouve ma goutte de laminine.Il est très important de concentrer vos cellules exactement au centre du champ, car nous obtenons environ 10 000 cellules par cerveau, et c'est ce que nous utilisons pour réaliser une culture unique. Très bien, maintenant, en observant au microscope, voici neuf cerveaux qui ont déjà subi la procédure de dissociation enzymatique. Vous pouvez constater qu'ils sont encore largement intacts.Ils n'ont pas leurs lobes optiques. Ceux-ci ont été retirés, mais nous avons seulement la région du cerveau central, et maintenant je vais pipeter un seul cerveau et le transférer vers la goutte de cinq microlitres sur une lamelle. Et je fais cela quatre fois.Je prends deux seringues d'un cm³ munies d'aiguilles de calibre 27. Encore une fois, il est très important de noter qu'il s'agit d'outils de dissection très peu coûteux et jetables, ce qui permet aux étudiants de licence de réaliser cette manipulation sans souci budgétaire. Très bien, j'ai maintenant mes deux aiguilles et je vais effectuer la dissociation mécanique initiale, qui consiste simplement à découper ce cerveau en plusieurs morceaux, ce qui me permettra ensuite d'aspirer ces fragments dans une pipette en verre en quelques instants pour achever la dissociation finale.Quand je fais cela, je ne les réduis pas en minuscules morceaux ; je souhaite simplement diminuer la taille totale afin d'obtenir des fragments un peu plus petits, de sorte que la pipette, lors de la dissociation, aspire des morceaux légèrement plus petits que ceux du cerveau entier. Je veux aussi procéder relativement rapidement, car les gouttes de milieu sont petites. Cela signifie que nous avons un rapport surface/volume élevé, et le pH ainsi que l'osmolarité de la solution peuvent changer si je la laisse exposée pendant une durée quelconque.Quand je faisais cela pour la première fois, je ne préparais en réalité que deux cerveaux à la fois, deux cultures à la fois. Maintenant, j'en prépare généralement quatre, et maintenant je vais casser la pipette, mais je ne peux pas en parler ni rien dire à ce sujet, n'est-ce pas ? Celui-ci, je viens de le terminer.La dissociation, la taille de la pipette était assez bonne. J'ai pu aspirer le tissu plusieurs fois vers le haut et vers le bas, et on peut voir des cellules individuelles ; nous avons encore des agrégats, mais ce n'est pas grave. Ils seront éliminés par lavage.Maintenant, les cultures, dès qu'elles ont été ensemencées, sont placées dans une deuxième boîte de Petri et introduites dans l'incubateur à CO2 en quelques minutes, car nous voulons nous assurer de maintenir le pH et l'osmolarité à un niveau propice à leur survie. Nous les laissons donc ici pendant 30 minutes avant de remplir la boîte. Ces cultures ont été préparées à partir des cerveaux de nymphes au stade tardif.La culture a été incubée pendant deux jours dans un incubateur à CO₂, et vous pouvez observer des cellules individuelles qui ont développé des prolongements. L'importance du développement des prolongements est inférieure à ce que l'on observe au cinquième jour, mais supérieure à ce que l'on voit au premier jour. Je m'appelle Jorge Ano.Je travaille dans le laboratoire Doubts. Je vais vous montrer maintenant comment nous réalisons l'expérience, l'expérience d'imagerie calcique sur des cultures cellulaires que nous venons de préparer. Il s'agit d'une vidéo d'une expérience d'imagerie calcique où vous voyez des cellules bleues indiquant de faibles niveaux de calcium et des cellules rouges indiquant des niveaux élevés de calcium.Nous allons observer que certaines cellules deviennent rouges, ce qui indique une augmentation des concentrations intracellulaires de calcium. Ces augmentations sont spontanées et transitoires. Elles reviennent progressivement à des niveaux normaux de calcium au fil du temps, puis, après un certain temps, nous allons appliquer un médicament, dans ce cas de la nicotine, et vous verrez que les cellules augmentent leurs concentrations intracellulaires de calcium.Nous appliquons de la nicotine pendant 100 secondes, puis nous retirons la nicotine, et ensuite les cellules reviennent à des niveaux basaux de calcium. Le véritable avantage de ce système de culture est que nous sommes en mesure de préparer nos cultures à partir de lignées de mouches transgéniques et mutantes, différentes lignées dans lesquelles diverses sous-populations de neurones sont marquées avec la GFP. Il s'agit du cerveau provenant d'une des lignées que nous avons utilisées, dans laquelle la GFP est exprimée dans le corps en crochets, les cellules de Kenyon, des neurones impliqués dans la médiation de comportements complexes, notamment l'apprentissage et la mémoire.Les corps cellulaires sont situés dans la région dorsale du cerveau, autour de l'endroit indiqué par les flèches rouges. Ces structures en forme de L, positives pour la GFP, sont en réalité les prolongements axonaux issus de ces cellules kényennes du corps en forme de champignon. Après dissociation de ce tissu cérébral.Les neurones régénèrent leurs prolongements en culture, et vous pouvez facilement identifier les cellules kényanes positives pour la GFP dans ce cas. Celles-ci sont accessibles à la fois aux enregistrements électrophysiologiques standards et aux études d'imagerie calcique. Par conséquent, ces cultures constituent des outils très utiles pour explorer les facteurs génétiques et environnementaux importants dans la régulation de la fonction des neurones, que nous savons jouer un rôle clé dans la médiation des comportements complexes chez l'animal adulte.

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Un paradigme blessures en utilisant le cordon Drosophile larvaire nerveuse ventrale pour enquêter régénération du système nerveux central et de la réparation est décrite. Stabbing suivi par microscopie confocale à balayage laser dans des échantillons de time-lapse et fixe, combinée à une analyse quantitative d'un logiciel développé à dessein et de la génétique, sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du SNC et de réparation.

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

Cellules S2 de drosophile et des neurones en culture sont de grands systèmes pour l'imagerie du transport motorisé organite in vivo. Nous décrivons ici des protocoles détaillés pour la culture des deux types de cellules, leur imagerie et d'analyse de transport.

Organite Transport en culture d' Drosophila Cellules: S2 Cell Line et neurones primaires.

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Le but du présent protocole est d’établir la culture ex vivo Drosophila cerveau larvaire optimisée pour surveiller des rythmes circadiens moléculaires avec imagerie Time-lapse à long terme de fluorescence. On discute également l’application de cette méthode pour les essais pharmacologiques.

Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

Cet article fournit des protocoles détaillés pour infliger une lésion cérébrale traumatique pénétrante (PTBI) à la drosophile adulte et examiner la neurogenèse qui en résulte.

Stimuler et analyser la neurogenèse adulte dans le cerveau central de la drosophile

Une méthode pour réactiver les cellules souches neurales quiescentes dans les explants cérébraux de drosophiles en culture a été établie. En utilisant cette méthode, le rôle des signaux systémiques peut être découplé des signaux intrinsèques des tissus dans la régulation de la quiescence, de l’entrée et de la sortie des cellules souches neurales.

Réactivation des cellules souches neurales dans les explants cérébraux de drosophiles en culture

Découvrez la préparation de cultures neuronales primaires à partir de cerveaux de pupes tardives de Drosophila. Cette méthode permet d'étudier la croissance des neurites et la dynamique calcique par imagerie Fura-2.

Cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes

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