drosophile Essai d’enfouissement et d’effet tunnel : une méthode pour évaluer l’hypoxie tissulaire chez les larves de mouches

- Pour mettre en place la cage de collecte d’embryons, utilisez des plaques de gélose au jus de raisin complétées par de la pâte de levure fraîche et placez les plaques sur des cages contenant des mouches drosophiles mâles et femelles du génotype approprié. L’odeur de la levure et du jus de raisin est attrayante et favorise la ponte des femelles. Laisser pondre les œufs pendant une période déterminée. Retirez ensuite les adultes et incubez les plaques embryonnaires pendant 24 heures pour obtenir les larves du premier stade. Ensuite, transférez doucement quelques larves individuelles de la plaque de jus de raisin sur une plaque d’essai uniquement à base d’agar-gélose où un trou dans la gélose au centre de la plaque a été découpé et rempli de pâte de levure.

Les jeunes larves doivent se nourrir pour prendre du poids corporel et se développer, elles s’enfouissent donc dans la source de nourriture, la pâte de levure. Au fur et à mesure de leur développement, les larves entrent dans une phase d’errance et creusent des tunnels pour s’éloigner de la nourriture à la recherche d’un site de nymphose. Pour évaluer l’hypoxie, examinez les motifs d’effet tunnel que les larves forment dans le substrat. L’absence ou l’insuffisance de tunnels est un signe de privation d’oxygène. Dans l’exemple de protocole, nous allons voir comment mettre en place le test d’enfouissement et de tunnel.

- Mettre en place le contrôle et les croisements génétiques expérimentaux dans les boîtes de ponte comme décrit dans le protocole textuel. Gardez les mouches dans l’obscurité pendant au moins deux jours avant de commencer les collectes d’œufs chronométrées. Pour la collecte chronométrée des œufs, transférez les adultes dans de nouvelles plaques de gélose aux raisins décorées d’une nouvelle couche de pâte de levure tôt dans la journée et laissez les adultes pondre les œufs sur les plaques pendant quatre heures. Après quatre heures, transférez les adultes dans des assiettes fraîches de gélose aux raisins.

Ensuite, incubez les plaques de collecte de quatre heures pendant la nuit à 25 degrés Celsius. Le lendemain après-midi, la plupart des larves auront éclos. Prévoyez d’en avoir au moins 50 pour chaque groupe expérimental.

Pour une seule série d’essais, préparez au moins cinq plaques d’essai par groupe expérimental. Ajouter 16 grammes de gélose tue-mouches dans 700 millilitres d’eau déminéralisée en chauffant. Préparez 17,5 millilitres de Nipagen dans de l’éthanol à 95 %. Chauffez la solution de gélose jusqu’à ce qu’elle soit presque complètement dissoute. Ajoutez ensuite la solution de Nipagen à la solution de gélose et faites chauffer jusqu’à ce que la gélose se dissolve complètement. Refroidissez brièvement la solution de gélose, puis chargez des plaques de 10 centimètres avec 15 millilitres de solution de gélose. Une fois que l’agar se gélifie, placez les couvercles sur les assiettes et laissez-les sécher à température ambiante pendant quelques heures ou toute la nuit.

La gélose séchée doit être ferme au toucher et résister à l’effritement lorsque des morceaux en sont coupés. Une fois que la gélose a durci, utilisez une perceuse de liège de 1,5 centimètre pour faire un trou central dans le gel de gélose dans chaque plaque. Ensuite, remplissez soigneusement les trous avec de la pâte de levure fraîche.

Pour transférer les larves sur la plaque de test, fabriquez un outil simple. Pliez une courbe dans l’extrémité d’une microspatule en plastique et trempez l’extrémité dans de la pâte de levure pour la rendre adhésive aux larves. Maintenant, ramassez les larves du premier stade individuellement et placez-les sur la plaque de gélose près du monticule de nourriture. Pour chaque groupe expérimental, préparez au moins cinq assiettes contenant chacune 10 larves.

Pour assurer la reproductibilité entre les répétitions d’essai, il est essentiel que seulement 10 larves soient placées sur chaque plaque d’essai. Assurez-vous de vérifier attentivement la plaque de dosage pour déterminer qu’une seule et unique larve est transférée chaque fois que vous libérez une larve avec la pointe de la microspatule.

Une fois la plaque chargée, étiquetez-la, couvrez-la, puis placez-la dans l’obscurité avec le couvercle vers le haut à température ambiante. Examinez chaque plaque tous les jours jusqu’à ce que toutes les larves soient mortes ou se soient nymphosées. Voici des exemples de plaques pour une souche de type sauvage du deuxième au huitième jour de l’essai. Le deuxième jour, les larves sont enfouies dans la nourriture et il n’y a pas de creusement de tunnels. Le creusement de tunnels commence le troisième jour et atteint un maximum entre le cinquième et le huitième jour, lorsque les larves cessent de se promener et se nymphosent dans leurs tunnels.

Transférez soigneusement les pupes avec une aiguille de taquinerie pliée dans une assiette à raisin et, si vous le souhaitez, comptez le nombre de pupes qui s’y trouvent. Prenez note de la formation des pupes et évaluez les pupes pour détecter des anomalies.