Name: Grands écrans des banques métagénomiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Découvrez l'inoculation robotisée de 10 000 colonies de banques métagénomiques sur membranes de nylon pour la recherche génomique. Cette méthode automatique améliore la précision et la reproductibilité des études microbiennes.

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1. Procédure d&#39;hybridation Un tube d&#39;hybridation aura 1 ou 2 membranes (taille 22 par 22 cm). Utilisez 50 ml de mélange d&#39;hybridation et de 0,5 mg d&#39;ADN de la sonde (10 ng / ml de concentration finale) par tube d&#39;hybridation. Pour de meilleurs résultats, utilisez un gel ADN purifié comme sonde. Si l&#39;échelle jusqu&#39;à la préparation de sonde, d&#39;augmenter le nombre de tubes plutôt que d&#39;augmenter la quantité de réactifs par tube. Sonde de préparation (0,5 mg ADN): <ol><li> Diluer 15 pi de cross-linker solution avec 60 pl d&#39;eau. </li><li> Diluer l&#39;ADN à 10 ng / ul avec de l&#39;eau à 50 volume total ul dans un microtube à bouchon à vis. </li><li> Dénaturer l&#39;ADN pendant 5 min dans l&#39;eau bouillante. </li><li> Transfert rapide de la glace et laisser refroidir pendant 5 min. Spin brièvement. </li><li> Ajouter 50 ul de tampon de réaction et mélanger doucement. </li><li> Ajouter 10 ul de réactif de marquage et mélanger doucement. </li><li> Ajouter 50 ul de la dilution réticulant solution de l&#39;étape 1 et mélanger délicatement. Vortex doucement et centrifuger brièvement. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Restez sur la glace pendant 2 h ou ajouter un volume égal de glycérol à 100% et conserver à -20 ° C. Remarque: Utilisez l&#39;eau fournie avec le kit. Conservez tous les réactifs sur la glace, sauf indication contraire. </li></ol> Préparation de membrane et d&#39;hybridation <ol><li> Préchauffer 50 ml de tampon d&#39;hybridation et de tube d&#39;hybridation à 60 ° C. </li><li> Ajouter le tampon d&#39;hybridation pour le tube d&#39;hybridation. Rouler à membrane (s) et ajouter à tube d&#39;hybridation. (Si vous ajoutez deux membranes par tube, premier rouleau jusqu&#39;à une membrane complètement, puis rouler la membrane d&#39;autres sur le dessus dans la même direction.) </li><li> Incuber le tube d&#39;hybridation à 60 ° C pendant au moins ½ h. (Assurez-vous que la membrane (s) se mouiller à fond.) </li><li> Transférer environ 1 ml de tampon d&#39;hybridation avec une pipette à long du tube d&#39;hybridation pour le tube contenant la sonde marquée. Vortex doucement et centrifuger brièvement. Transférer le mélange revenir à tube d&#39;hybridation. </li><li> Incuber à 60 ° C pendant la nuit. Remarque: Utilisez une pince et des gants lorsque vous manipulez des membranes. Mélanger le contenu des tubes d&#39;hybridation douce, car trop d&#39;agitation va provoquer la formation permanente de mousse indésirables. Membranes devraient être ajoutés à l&#39;état humide; tremper dans le tampon d&#39;hybridation ou de l&#39;eau si nécessaire et drainer l&#39;excès de liquide avant d&#39;ajouter. </li></ol> 2. Procédure de détection Membranes laver <ol><li> Préchauffer le tampon de lavage des primaires à 60 ° C. (Utilisez four micro-ondes et / ou plaque chauffante). </li><li> S&#39;il ya deux membranes dans un tube d&#39;hybridation, transférer une membrane pour un environnement propre, préchauffé, tube d&#39;hybridation vide. </li><li> Rincer brièvement tube d&#39;hybridation avec environ 50 ml de tampon de lavage primaire. </li><li> Ajouter environ 100 ml de tampon de lavage primaire au tube d&#39;hybridation et incuber à 60 ° C pendant 10 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 3 et 4. </li><li> Transfert à membrane pour le lavage de conteneurs et incuber avec au moins 250 ml de tampon de lavage secondaire à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 6. Remarque: Les membranes peuvent être conservés dans le tampon de lavage secondaire à température ambiante pendant jusqu&#39;à ½ h avant la génération du signal. </li></ol> La génération de signaux et de détection (procédure pour une membrane) <ol><li> Deux morceaux de ruban SaranWrap à plat sur la table (un pour l&#39;étape 2 et un pour l&#39;étape 4). </li><li> Soigneusement drainer l&#39;excès de tampon de la membrane par toucher les coins de la membrane contre le côté du conteneur et transférer la membrane sur la SaranWrap (côté de l&#39;échantillon vers le haut). </li><li> Verser ml 6-7 de réactifs ECF sur la membrane et plier Saran sur la membrane. Soigneusement distribuer réactif ECF sur la membrane par un léger déplacement d&#39;une Kimwipe sur le SaranWrap. Incuber pendant 5 min. </li><li> Égoutter l&#39;excès de réactifs ECF de la membrane et le transférer sur de nouveaux SaranWrap, enveloppez fois sur la membrane, et sceller les bords avec du ruban adhésif. Couvrir la membrane avec du papier aluminium. Incuber pendant 1-2 heures. </li><li> Préparer la vitre du scanner en distribuant 1-2 ml de réactif ECF sur la plaque de verre. Puis transfert de la membrane sur la plaque de verre (côté de l&#39;échantillon vers le bas) et de distribuer une autre 1-2 ml de réactif ECF sur la membrane. Superposition avec SaranWrap et poussez délicatement toutes les bulles d&#39;air loin de la membrane. (Vous pouvez placer une plaque rigide sur le dessus du SaranWrap pour maintenir la membrane plaquée contre la plaque de verre.) </li><li> Utilisez le Fuji FLA-5100 scanner de fluorescence (&quot;1 laser 1 image&quot; mode) avec les paramètres suivants: excitation 473 nm, filtre de détection LPB (510 nm), la résolution de 50 microns, la graduation du signal 16 bits, 400 V. CH1 (Scan prend environ 15-20 min par la membrane de taille 22 par 22 cm.) En option: </li><li> Laissez reposer pendant 2-4 heures (ou plus). </li><li> Répétez scanner comme à l&#39;étape 6. </li></ol> 3. Le décapage et le stockage procédure (NUF version) <ol><li> Transfert de membrane à 100% etHanol et incuber à température ambiante pendant 10 min avec agitation douce. </li><li> Remplacer avec de l&#39;éthanol à 100% frais et incuber une nuit à température ambiante. (Membrane peut rester dans l&#39;éthanol pendant plusieurs jours.) </li><li> Remplacer l&#39;éthanol avec de l&#39;eau distillée et incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Ajouter 100 ml d&#39;eau et 5 ml de SDS à 10% (finale du SDS 0,5%) à un tube d&#39;hybridation et mélanger doucement. Ajouter à membrane. </li><li> Incuber à 80 ° C pendant 1 h. </li><li> Transfert à membrane pour un récipient propre et vide. </li><li> Ajouter 500 ml d&#39;eau et 5 ml de SDS à 10% (finale SDS 0,1%) un bécher et amener à ébullition vigoureuse dans le four à micro-ondes. </li><li> Verser la quasi-bouillante solution à 0,1% de SDS sur la membrane et agiter doucement pendant quelques minutes. Laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Rincer à au moins 250 ml de solution stérile 100 mM de Tris pH 8 pendant au moins 10 min. </li><li> Envelopper dans la membrane SaranWrap et les bords soigneusement étroite avec des rubans. Conserver à 4 ° C. (Membranes ne doit jamais se dessécher.) </li></ol>

La procédure de dépouillement n&#39;a pas été optimisée. Toutefois, la procédure de décapage donné dans les instructions du fabricant (2 lavages chacun, 10 min dans de l&#39;éthanol à 100%, 1 lavage de 1 h à 60 ° C dans du SDS 0,5%) est insuffisant. Au moins une nuit d&#39;incubation dans de l&#39;éthanol à 100% est nécessaire pour dissoudre le produit de la réaction ECF, plusieurs jours d&#39;incubation dans de l&#39;éthanol à 100% ne semble pas avoir d&#39;effets néfastes sur l&#39;aptitude à reprobe la membrane. Le fabricant du traitemen...

Combinaison sac RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

grands écrans des banques métagénomiques

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Métagénomique fragments bibliothèques grande archive de séquences génomiques contiguës à partir de microorganismes sans nécessiter de culture préalable. Génération d&#39;une procédure simplifiée pour la création et le criblage de métagénomique est donc utile pour l&#39;efficacité à haut débit des enquêtes sur les propriétés génétiques et métaboliques des assemblages microbiens incultes. Ici, les protocoles clés sont présentés sur vidéo, que nous proposons est le format le plus utile pour décrire avec précision un long processus qui dépend alternativement sur l&#39;instrumentation et les interventions manuelles robotisées (humain). Premièrement, nous avons utilisé la robotique de repérer les clones de bibliothèques sur des membranes macroarray haute densité, dont chacune peut contenir des colonies reproduire vingt à quatre plaques bibliothèque de 384 puits. L&#39;automatisation est essentielle pour cette procédure non seulement pour la précision et la vitesse, mais aussi en raison de la miniaturisation d&#39;échelle nécessaires pour s&#39;adapter au grand nombre de clones de la banque en très dense arrangements spatiaux. Une fois produite, nous avons ensuite montré comment les membranes macroarray peuvent être criblés pour des gènes d&#39;intérêt en utilisant des versions modifiées des protocoles standard pour l&#39;étiquetage de sonde, l&#39;hybridation membrane, et la détection du signal. Nous avons complété la démonstration visuelle de ces procédures avec des descriptions détaillées écrite des étapes et le matériel requis, qui sont tous disponibles en ligne aux côtés de la vidéo.

Grands écrans des banques métagénomiques

Les bibliothèques métagénomiques archivent de larges fragments de séquences génomiques contiguës provenant de microorganismes sans nécessiter de culture préalable. La génération d'une...

Notre objectif ici est donc d'ensemencer des colonies provenant de certaines de ces bibliothèques métagénomiques sur des filtres membranaires, et chacun de ces filtres peut contenir 10 000 colonies. Ce que fait actuellement rums consiste à poser ce filtre en nylon sur un bloc et à le lisser légèrement. Il est imbibé d'un peu de liquide, simplement le milieu de croissance, le bouillon luria.Et ce qu’il va ensuite faire, c’est transférer cette membrane humidifiée vers le robot, qui va automatiquement ensemencer cette membrane avec 10 000 colonies. La robotique est essentielle pour ce type de procédure, car aucune personne ne possède réellement la patience ou la précision nécessaire pour déposer 10 000 colonies sur une de ces membranes. Les robots font partie des éléments qui ont réellement fait progresser la science génomique, en permettant d’effectuer des opérations très répétitives et à une échelle spatiale réduite avec une grande précision.Pour l'instant, le robot est en cours de configuration pour alimenter ces 3 plaques de 84 puits, chaque puits de ces 3 plaques de 84 puits contenant une colonie individuelle issue de la bibliothèque métagénomique. Actuellement, le robot stérilis

large-scale-screens-of-metagenomic-libraries

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit un écran haut débit pour l'activité cellulolytique d'une banque métagénomique exprimé dans Escherichia coli. L'écran est la solution basée et hautement automatisé et utilise un pot de chimie dans des microplaques 384 puits avec la lecture finale comme une mesure d'absorbance.

Un écran à haut débit pour la bioprospection minière activité cellulase à partir des bibliothèques métagénomique

Nous avons développé complètes, impartiales échelle du génome écrans à comprendre gène-médicament et les interactions gènes-environnement. Méthodes de dépistage de ces collections de mutants sont présentées.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

Source : Kim, H. et al., Dépistage multi-enzymatique utilisant un système de criblage enzymatique génétique à haut débit. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre une méthode de dépistage génétique permettant de détecter l’expression enzymatique à l’aide de bibliothèques de fosmides métagénomiques et de substrats chromogéniques. La cytométrie en flux identifie et isole des cellules individuelles produisant des produits colorés, permettant une sélection à haut débit des cellules actives exprimant...

Détection de l’expression de l’enzyme cible dans les cellules bactériennes génétiquement modifiées

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Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d&#39;échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement

Ce travail présente une méthode de criblage à haut débit utilisant un système universel de criblage enzymatique génétique qui peut théoriquement être appliqué à plus de 200 enzymes. Ici, le système de criblage unique identifie trois enzymes différentes (lipase, cellulase et phosphatase alcaline) en changeant simplement le substrat utilisé (acétate de p-nitrophényle, p-nitrophényl-β-D-cellobioside et phosphate de phényle).

Multi-enzyme préalable au moyen d&#39;un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

La métagénomique a été utilisée pour étudier le microbiome des aliments pour bovins d’ensilage. L’analyse a été effectuée par séquençage shotgun. Cette approche a été utilisée pour caractériser la composition de la communauté microbienne dans l’alimentation du bétail.

Métagénomique Analyse des Ensilage

L’identification des interactions physiques entre les gènes et les éléments de régulation est difficile, mais a été facilitée par les méthodes de capture de conformation du chromosome. Cette modification du protocole 4C-seq atténue la partialité de la PCR en réduisant au minimum l’amplification excessive des modèles PCR et maximise la mappability se lit en y incorporant une étape digest d’enzyme de restriction addition.

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La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

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Profilage multiomique spatialement résolu et intégré à cellules uniques du transcriptome et des cibles épigénomiques dans les sections de tissu gelé

Découvrez l'inoculation robotisée de 10 000 colonies de banques métagénomiques sur membranes de nylon pour la recherche génomique. Cette méthode automatique améliore la précision et la reproductibilité des études microbiennes.

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