Name: Grands écrans des banques métagénomiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Découvrez l'inoculation robotisée de 10 000 colonies de banques métagénomiques sur membranes de nylon pour la recherche génomique. Cette méthode automatique améliore la précision et la reproductibilité des études microbiennes.

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1. Procédure d&#39;hybridation Un tube d&#39;hybridation aura 1 ou 2 membranes (taille 22 par 22 cm). Utilisez 50 ml de mélange d&#39;hybridation et de 0,5 mg d&#39;ADN de la sonde (10 ng / ml de concentration finale) par tube d&#39;hybridation. Pour de meilleurs résultats, utilisez un gel ADN purifié comme sonde. Si l&#39;échelle jusqu&#39;à la préparation de sonde, d&#39;augmenter le nombre de tubes plutôt que d&#39;augmenter la quantité de réactifs par tube. Sonde de préparation (0,5 mg ADN): <ol><li> Diluer 15 pi de cross-linker solution avec 60 pl d&#39;eau. </li><li> Diluer l&#39;ADN à 10 ng / ul avec de l&#39;eau à 50 volume total ul dans un microtube à bouchon à vis. </li><li> Dénaturer l&#39;ADN pendant 5 min dans l&#39;eau bouillante. </li><li> Transfert rapide de la glace et laisser refroidir pendant 5 min. Spin brièvement. </li><li> Ajouter 50 ul de tampon de réaction et mélanger doucement. </li><li> Ajouter 10 ul de réactif de marquage et mélanger doucement. </li><li> Ajouter 50 ul de la dilution réticulant solution de l&#39;étape 1 et mélanger délicatement. Vortex doucement et centrifuger brièvement. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Restez sur la glace pendant 2 h ou ajouter un volume égal de glycérol à 100% et conserver à -20 ° C. Remarque: Utilisez l&#39;eau fournie avec le kit. Conservez tous les réactifs sur la glace, sauf indication contraire. </li></ol> Préparation de membrane et d&#39;hybridation <ol><li> Préchauffer 50 ml de tampon d&#39;hybridation et de tube d&#39;hybridation à 60 ° C. </li><li> Ajouter le tampon d&#39;hybridation pour le tube d&#39;hybridation. Rouler à membrane (s) et ajouter à tube d&#39;hybridation. (Si vous ajoutez deux membranes par tube, premier rouleau jusqu&#39;à une membrane complètement, puis rouler la membrane d&#39;autres sur le dessus dans la même direction.) </li><li> Incuber le tube d&#39;hybridation à 60 ° C pendant au moins ½ h. (Assurez-vous que la membrane (s) se mouiller à fond.) </li><li> Transférer environ 1 ml de tampon d&#39;hybridation avec une pipette à long du tube d&#39;hybridation pour le tube contenant la sonde marquée. Vortex doucement et centrifuger brièvement. Transférer le mélange revenir à tube d&#39;hybridation. </li><li> Incuber à 60 ° C pendant la nuit. Remarque: Utilisez une pince et des gants lorsque vous manipulez des membranes. Mélanger le contenu des tubes d&#39;hybridation douce, car trop d&#39;agitation va provoquer la formation permanente de mousse indésirables. Membranes devraient être ajoutés à l&#39;état humide; tremper dans le tampon d&#39;hybridation ou de l&#39;eau si nécessaire et drainer l&#39;excès de liquide avant d&#39;ajouter. </li></ol> 2. Procédure de détection Membranes laver <ol><li> Préchauffer le tampon de lavage des primaires à 60 ° C. (Utilisez four micro-ondes et / ou plaque chauffante). </li><li> S&#39;il ya deux membranes dans un tube d&#39;hybridation, transférer une membrane pour un environnement propre, préchauffé, tube d&#39;hybridation vide. </li><li> Rincer brièvement tube d&#39;hybridation avec environ 50 ml de tampon de lavage primaire. </li><li> Ajouter environ 100 ml de tampon de lavage primaire au tube d&#39;hybridation et incuber à 60 ° C pendant 10 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 3 et 4. </li><li> Transfert à membrane pour le lavage de conteneurs et incuber avec au moins 250 ml de tampon de lavage secondaire à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 6. Remarque: Les membranes peuvent être conservés dans le tampon de lavage secondaire à température ambiante pendant jusqu&#39;à ½ h avant la génération du signal. </li></ol> La génération de signaux et de détection (procédure pour une membrane) <ol><li> Deux morceaux de ruban SaranWrap à plat sur la table (un pour l&#39;étape 2 et un pour l&#39;étape 4). </li><li> Soigneusement drainer l&#39;excès de tampon de la membrane par toucher les coins de la membrane contre le côté du conteneur et transférer la membrane sur la SaranWrap (côté de l&#39;échantillon vers le haut). </li><li> Verser ml 6-7 de réactifs ECF sur la membrane et plier Saran sur la membrane. Soigneusement distribuer réactif ECF sur la membrane par un léger déplacement d&#39;une Kimwipe sur le SaranWrap. Incuber pendant 5 min. </li><li> Égoutter l&#39;excès de réactifs ECF de la membrane et le transférer sur de nouveaux SaranWrap, enveloppez fois sur la membrane, et sceller les bords avec du ruban adhésif. Couvrir la membrane avec du papier aluminium. Incuber pendant 1-2 heures. </li><li> Préparer la vitre du scanner en distribuant 1-2 ml de réactif ECF sur la plaque de verre. Puis transfert de la membrane sur la plaque de verre (côté de l&#39;échantillon vers le bas) et de distribuer une autre 1-2 ml de réactif ECF sur la membrane. Superposition avec SaranWrap et poussez délicatement toutes les bulles d&#39;air loin de la membrane. (Vous pouvez placer une plaque rigide sur le dessus du SaranWrap pour maintenir la membrane plaquée contre la plaque de verre.) </li><li> Utilisez le Fuji FLA-5100 scanner de fluorescence (&quot;1 laser 1 image&quot; mode) avec les paramètres suivants: excitation 473 nm, filtre de détection LPB (510 nm), la résolution de 50 microns, la graduation du signal 16 bits, 400 V. CH1 (Scan prend environ 15-20 min par la membrane de taille 22 par 22 cm.) En option: </li><li> Laissez reposer pendant 2-4 heures (ou plus). </li><li> Répétez scanner comme à l&#39;étape 6. </li></ol> 3. Le décapage et le stockage procédure (NUF version) <ol><li> Transfert de membrane à 100% etHanol et incuber à température ambiante pendant 10 min avec agitation douce. </li><li> Remplacer avec de l&#39;éthanol à 100% frais et incuber une nuit à température ambiante. (Membrane peut rester dans l&#39;éthanol pendant plusieurs jours.) </li><li> Remplacer l&#39;éthanol avec de l&#39;eau distillée et incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Ajouter 100 ml d&#39;eau et 5 ml de SDS à 10% (finale du SDS 0,5%) à un tube d&#39;hybridation et mélanger doucement. Ajouter à membrane. </li><li> Incuber à 80 ° C pendant 1 h. </li><li> Transfert à membrane pour un récipient propre et vide. </li><li> Ajouter 500 ml d&#39;eau et 5 ml de SDS à 10% (finale SDS 0,1%) un bécher et amener à ébullition vigoureuse dans le four à micro-ondes. </li><li> Verser la quasi-bouillante solution à 0,1% de SDS sur la membrane et agiter doucement pendant quelques minutes. Laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Rincer à au moins 250 ml de solution stérile 100 mM de Tris pH 8 pendant au moins 10 min. </li><li> Envelopper dans la membrane SaranWrap et les bords soigneusement étroite avec des rubans. Conserver à 4 ° C. (Membranes ne doit jamais se dessécher.) </li></ol>

La procédure de dépouillement n&#39;a pas été optimisée. Toutefois, la procédure de décapage donné dans les instructions du fabricant (2 lavages chacun, 10 min dans de l&#39;éthanol à 100%, 1 lavage de 1 h à 60 ° C dans du SDS 0,5%) est insuffisant. Au moins une nuit d&#39;incubation dans de l&#39;éthanol à 100% est nécessaire pour dissoudre le produit de la réaction ECF, plusieurs jours d&#39;incubation dans de l&#39;éthanol à 100% ne semble pas avoir d&#39;effets néfastes sur l&#39;aptitude à reprobe la membrane. Le fabricant du traitemen...

Combinaison sac RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

grands écrans des banques métagénomiques

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Métagénomique fragments bibliothèques grande archive de séquences génomiques contiguës à partir de microorganismes sans nécessiter de culture préalable. Génération d&#39;une procédure simplifiée pour la création et le criblage de métagénomique est donc utile pour l&#39;efficacité à haut débit des enquêtes sur les propriétés génétiques et métaboliques des assemblages microbiens incultes. Ici, les protocoles clés sont présentés sur vidéo, que nous proposons est le format le plus utile pour décrire avec précision un long processus qui dépend alternativement sur l&#39;instrumentation et les interventions manuelles robotisées (humain). Premièrement, nous avons utilisé la robotique de repérer les clones de bibliothèques sur des membranes macroarray haute densité, dont chacune peut contenir des colonies reproduire vingt à quatre plaques bibliothèque de 384 puits. L&#39;automatisation est essentielle pour cette procédure non seulement pour la précision et la vitesse, mais aussi en raison de la miniaturisation d&#39;échelle nécessaires pour s&#39;adapter au grand nombre de clones de la banque en très dense arrangements spatiaux. Une fois produite, nous avons ensuite montré comment les membranes macroarray peuvent être criblés pour des gènes d&#39;intérêt en utilisant des versions modifiées des protocoles standard pour l&#39;étiquetage de sonde, l&#39;hybridation membrane, et la détection du signal. Nous avons complété la démonstration visuelle de ces procédures avec des descriptions détaillées écrite des étapes et le matériel requis, qui sont tous disponibles en ligne aux côtés de la vidéo.

Grands écrans des banques métagénomiques

Les bibliothèques métagénomiques archivent de larges fragments de séquences génomiques contiguës provenant de microorganismes sans nécessiter de culture préalable. La génération d'une...

Notre objectif ici est donc d'ensemencer des colonies provenant de certaines de ces bibliothèques métagénomiques sur des filtres membranaires, et chacun de ces filtres peut contenir 10 000 colonies. Ce que fait actuellement rums consiste à poser ce filtre en nylon sur un bloc et à le lisser légèrement. Il est imbibé d'un peu de liquide, simplement le milieu de croissance, le bouillon luria.Et ce qu’il va ensuite faire, c’est transférer cette membrane humidifiée vers le robot, qui va automatiquement ensemencer cette membrane avec 10 000 colonies. La robotique est essentielle pour ce type de procédure, car aucune personne ne possède réellement la patience ou la précision nécessaire pour déposer 10 000 colonies sur une de ces membranes. Les robots font partie des éléments qui ont réellement fait progresser la science génomique, en permettant d’effectuer des opérations très répétitives et à une échelle spatiale réduite avec une grande précision.Pour l'instant, le robot est en cours de configuration pour alimenter ces 3 plaques de 84 puits, chaque puits de ces 3 plaques de 84 puits contenant une colonie individuelle issue de la bibliothèque métagénomique. Actuellement, le robot stérilise les aiguilles d'inoculation qu'il utilisera pour déposer les échantillons sur la membrane. Il les fait donc passer par plusieurs solutions différentes, dont l'une est de l'éthanol à 70 %, afin de les stériliser, puis ces aiguilles d'inoculation seront trempées dans une plaque de 3 84 puits contenant toutes les colonies.Il est maintenant stérilisé et séché par la lumière. Une fois que les aiguilles d'ensemencement sont sèches, une plaque sera introduite dans le robot. Chacune de ces colonies est en réalité transférée et dupliquée, ce qui sert de contrôle.Nous recherchons donc en réalité deux colonies identiques afin d'obtenir un signal issu de l'hybridation. Une fois toutes ces colonies déposées sur le filtre, on les applique de nouveau sur la boîte de culture que vous voyez ici, puis on les incube à 37 degrés C toute la nuit.Ce qui se produit est que les colonies se développent individuellement et ce que l'on observe sur le réseau est un ensemble de 10 000 colonies sur un filtre. Bien entendu, chacune de ces colonies contient de très nombreuses copies de l'ADN recombinant, dans ce cas précis de l'ADN métagénomique. Cet échantillon provient du centre de l'océan Pacifique Nord que nous avons préparé.Ensuite, Saltram va transférer cette membrane dans une série de solutions. La première solution dans laquelle il effectue le transfert est une solution basique d'hydroxyde de sodium, qui va lyser les colonies. Elle dissout essentiellement la paroi cellulaire et libère l'ADN afin que celui-ci entre en contact avec le filtre.Ce qui se produit ici est la dissolution de toutes les parois cellulaires de toutes les bactéries présentes dans ces colonies, et l'ADN est désormais libre. Après cinq minutes dans l'hydroxyde de sodium, les filtres sont ensuite transférés. Cet endroit sert simplement de support temporaire, car ensuite ils iront dans de la vapeur bouillante.Voici donc la deuxième partie de l'étape de lyse. Tout d'abord, les cellules ont été traitées avec une solution fortement basique d'hydroxyde de sodium et de dodécylsulfate de sodium. À présent, ces colonies sont soumises à une forte chaleur, une chaleur de vapeur à cent degrés Celsius.La combinaison de cette base et de ce détergent avec cette chaleur va lyser complètement les cellules et l'ADN sera libre sur le filtre. Après cinq minutes dans la vapeur du ER, on va transférer ce filtre dans une solution neutralisante. La solution neutralisante neutralise essentiellement toute la base, puis le filtre sera séché.Voici maintenant la solution neutralisante, et on laisse tremper dedans pendant encore cinq minutes. Le filtre est ensuite transféré sur du papier buvard et laissé sécher, généralement toute une nuit. Après que les membranes contenant les cellules lysées aient séché toute une nuit, on les place dans une solution de triss, d’EDTA et de protéase K, la protéase K ayant pour but d’éliminer toutes les protéines présentes sur la membrane.Vous voyez que l'on a retourné la membrane pour s'assurer que toutes ces colonies soient recouvertes de protéase K. Celle-ci va digérer une grande partie des matériaux cellulaires superflus et des protéines. Après une incubation d'une demi-heure dans la protéase K à 37 degrés C, les membranes sont simplement retirées de la solution et séchées sur du papier buvard pendant la nuit. Elles sont alors prêtes pour l'étape suivante, qui est l'hybridation.Je m'appelle Vin fm. Je suis postdoctorant au laboratoire de Delong. Au MIT, j'utilise la technologie de puces macro-organisées pour cribler des marqueurs phylogénétiques ainsi que des gènes fonctionnels.Vous avez vu comment ces bibliothèques de macro-réseaux ont été préparées. Je vais vous guider à travers le reste de la procédure pour effectuer le criblage. Voici un macro-réseau ; avant de pouvoir poursuivre, nous devons fixer l'ADN sur la membrane elle-même par réticulation au moyen d'UV.Nous effectuons cela avec un lieur UV strata, plaçons cela à l'intérieur, réglons-le sur la liaison croisée automatique et démarrons. Une fois la liaison croisée terminée, j'aime découper les membranes en deux moitiés. Je procède ainsi parce que ces membranes seront hybridées à l'intérieur de ces tubes d'hybridation, et le fait de les couper en deux permet d'exposer entièrement la surface interne de la membrane à la solution d'hybridation.Vous pouvez constater que la membrane est parfaitement positionnée à l'intérieur du tube, sans se replier sur elle-même. Ici, la membrane est donc correctement placée à l'intérieur du tube d'hybridation. Ensuite, je vais y ajouter du tampon d'hybridation.Contenant la sonde, que j'ai dans ce autre tube préchauffé à 60 degrés. C'est ma température d'hybridation préférée. Avant de procéder, ou plutôt pendant que je le fais, je vais expliquer que le tampon d'hybridation nous a été envoyé avec notre kit de détection par le fabricant.Il s'agit du tampon d'hybridation, que nous complétons avec un réactif bloquant. Ce tampon contient également du tampon phosphate, du SDS, du chlorure de magnésium et du chlorure de sodium, ainsi que de l'urée. Parfait. Ensuite, on place ce tube contenant le tampon d'hybridation, la membrane et la sonde à l'intérieur de l'étuve d'hybridation, que j'ai réglée à 60 degrés, puis on laisse incuber toute la nuit sans intervention.Après une incubation idéale toute une nuit, il est temps de laver les membranes afin d'éliminer toute sonde non liée. Aucun matériau dangereux n'est utilisé lors de la préparation du tampon d'hybridation ou de la sonde. Il est donc sans risque de verser le liquide dans l'évier.Je vais chercher mon tampon de lavage primaire, qui se réchauffe également à 60 degrés. Il a été chauffé correctement à la même température que celle utilisée pour l'hybridation des membranes durant la nuit. Il sera également lavé à cette même température.Vous effectuez généralement trois lavages avec le tampon de lavage primaire, chaque incubation durant environ cinq à dix minutes. Encore une fois, le tampon de lavage ne contient pas de produits chimiques radioactifs ni dangereux ; après chaque cycle de lavage, vous pouvez verser le liquide dans l'évier. Effectuez trois lavages avec le tampon de lavage primaire à 60 degrés.Maintenant, les membranes sont prêtes pour le lavage secondaire, qui amène les membranes au pH approprié pour l'exposition aux réactifs de détection ECF. Ensuite, nous lavons les membranes dans du tampon de lavage secondaire à température ambiante. Vous pouvez maintenant utiliser des pinces pour retirer les membranes ou, si vous êtes très prudent, vous pouvez utiliser votre main gantée, en manipulant les membranes uniquement par le dos ou sur les bords, afin de ne pas laisser de traces dues à des contaminants présents sur vos mains, même gantées.Nous devons transférer les membranes dans un récipient contenant un tampon de lavage secondaire préparé et porté à température ambiante. Posez-les simplement bien à plat. Parfois, les membranes se chevauchent, mais ce n’est pas très important.N'oubliez pas que cette étape particulière sert uniquement à équilibrer le pH des membranes. Ensuite, laissez incuber. Vous pouvez effectuer un léger balancement si vous le souhaitez.Je n'ai pas constaté que cela soit particulièrement utile ou nuisible d'une manière ou d'une autre. Je laisse donc simplement l'échantillon sur mon plan de travail pendant cinq à dix minutes de nouveau, puis je répète le lavage secondaire une deuxième fois. Le second lavage du lavage secondaire est terminé.Il est maintenant temps de préparer la détection, étendre. J'étends donc un morceau de film plastique, sur lequel seront posées les membranes, côté du port des réactifs de détection vers le haut. Ensuite, je replie le film plastique par-dessus. Cela forme une petite poche bien pratique pour contenir le réactif de détection.Ici, nous avons nos membranes. Je fais égoutter tout excès de tampon de lavage sur des serviettes en papier sèches, en empilant plusieurs, puis je dispose les membranes sur du film Theran. Vous avez une détection ECF déjà prémélangée.On peut généralement les conserver plusieurs mois au congélateur ; je verse simplement les réactifs sur la membrane. Je plie le reste. Donc, j'enroule par-dessus.Et je forme une petite poche en repliant les extrémités ou les bords, puis je protège l'ensemble du processus de détection avec du papier d'aluminium. Je laisse agir pendant environ cinq à dix minutes supplémentaires. Il est alors temps d'éliminer les réactifs de détection de ce premier sac.Vous remarquerez que j'ai fixé une partie du film adhésif sur mon établi. Vous pourriez trouver cela souvent utile afin d'éviter ce type d'adhérence inévitable avec le film cera. Là encore, il est utile d'égoutter en tapotant sur une pile de serviettes en papier, puis de dérouler sur un nouveau film propre et net que vous aurez préalablement disposé sur l'établi.Très bien, les réactifs de détection ont donc été éliminés en grande partie. Les membranes sont maintenant prêtes pour une incubation d'environ deux heures afin de laisser le signal se développer. L'incubation de deux heures étant terminée, nous sommes prêts à détecter le signal sur nos membranes. Pour cela, nous utilisons un scanner fluorescent pour analyser les membranes, en veillant à ne manipuler celles-ci qu'aux bords.Ce qui pourrait s'avérer utile est d'utiliser une pipette pour éliminer les bulles qui se forment entre la membrane et le verre. Nous sommes donc prêts à effectuer la numérisation. Configurez la zone recouverte sur la plaque frontale par nos membranes et numérisez à quatre et 73 nanomètres.Ainsi, lorsque vous agrandissez une numérisation terminée, vous obtenez une image similaire à celle-ci. Vous avez un signal juste ici. Chaque fois que vous avez deux points opposés, cela indique un signal positif.Voici un exemple, voici un deuxième exemple. Une fois que vous savez quelle partie de la membrane porte le signal, vous remontez alors à la plaque et aux puits auxquels correspond ce signal particulier. Cela vous indiquera quel fo smidt porte le gène particulier que vous cherchiez à identifier grâce à votre criblage.Et une fois que vous avez identifié le smid, vous pouvez vous rechercher. Une méthode consiste simplement à séquencer tout l'insert du smid et à trouver le gène qui vous intéresse.

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