Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique

Afin de déterminer la rigidité à la flexion de cellules individuelles de coli, commencez par cultiver les bactéries jusqu'à la phase exponentielle, puis fixez-les sur une lame recouverte d'un support chimiquement traité. Laissez les cellules déjà attachées à la surface poursuivre leur croissance afin qu'elles développent des extrémités flexibles. Ensuite, introduisez des billes diélectriques par écoulement, piégez une bille et courbez-la jusqu'à l'extrémité flexible d'une cellule.

La dernière étape de la procédure consiste à courber la cellule à l’aide du piège optique et à mesurer les données de déplacement induit qui en résultent. La rigidité en flexion de la cellule peut être calculée par un ajustement linéaire des données de déplacement induit. Bonjour, je suis Steven Wong du laboratoire du professeur Joshua Shere à l’Institut Louis Sickler de génomique intégrative et du Département de physique de l’Université de Princeton.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de flexion de cellules bactériennes individuelles et de mesure de la rigidité cellulaire. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la contribution des différentes structures intracellulaires à l'intégrité mécanique des cellules bactériennes. Commençons donc.

Pour commencer cette procédure, faire croître trois millilitres de cellules d’E. coli quelconques en milieu LB jusqu’à la phase exponentielle. Une fois que les cellules atteignent une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,2 et 0,4, compléter la culture avec 50 microgrammes par millilitre de céphalexine pendant 15 minutes afin d’induire une croissance filamenteuse. Pendant ces 15 minutes, préparer une chambre d’écoulement.

Fixez deux morceaux de ruban adhésif double face avec un espace de trois millimètres entre eux sur une lame de verre, puis fixez une lamelle par-dessus. L'espace entre les morceaux de ruban adhésif crée un canal pour l'écoulement du liquide. Recouvrez la lamelle de PEI en faisant circuler 10 microlitres de polyéthylène à 1 % dilué dans l'eau dans la chambre d'écoulement à l'aide d'une micropipette, puis incubez pendant cinq minutes.

Ensuite, effectuez un lavage en faisant circuler 200 microlitres d'eau à une extrémité de la chambre et en recueillant à l'autre extrémité à l'aide d'un vide. Après 15 minutes de croissance des bactéries en présence de céphalexine, centrifugez un millilitre de cellules dans une microcentrifugeuse et remettez en suspension dans 200 microlitres de LV contenant de la céphalexine. Ensuite, utilisez à nouveau une micropipette à une extrémité et le vide à l'autre extrémité pour faire circuler 50 microlitres de la culture cellulaire concentrée dans la chambre contenant le coverslip revêtu, puis incubez pendant trois minutes.

Ensuite, lavez avec 50 microlitres de Vel B supplémenté en céphaléxine. Pour éliminer les cellules non attachées, incubez la chambre à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure afin de permettre la croissance des cellules attachées avant de les placer sur l'instrument de piégeage optique, pendant l'incubation des cellules. Préparez les billes revêtues de polylysine en incubant trois microlitres de billes de polystyrène de 0,5 micromètre de diamètre dans une solution de polylysine à 0,1 % diluée dans l'eau pendant 30 minutes.

Lorsque l'incubation des billes est terminée, lavez-les trois fois en les centrifugeant dans une microcentrifugeuse, puis en les resuspendant dans un millilitre d'eau. Procédez ensuite à la liaison des billes aux bactéries et mesurez la rigidité de liaison des cellules. L'aspect le plus délicat de ce protocole consiste à pouvoir récupérer, localiser et reconnaître une cellule adéquate pour les mesures de flexion et de rigidité. Une bonne cellule est une cellule dont l'extrémité fixée et l'extrémité libre sont bien définies.

Sur la chambre d'écoulement du microscope, recherchez une cellule présentant une extrémité bien définie et fixée. Certaines cellules ne sont attachées qu'à une seule de leurs extrémités, et la force de flexion à l'autre extrémité provoque une rotation complète de la cellule plutôt qu'une flexion. Pour trouver une cellule appropriée, fléchissez rapidement chaque cellule à l'aide du piège en utilisant le déplacement de la platine contrôlé par le joystick.

Lorsqu'une cellule appropriée est trouvée, diluer la solution de billes d'un facteur deux dans du lb contenant de la céphalexine, puis ajouter 30 microlitres de la solution de billes dans la chambre d'écoulement en pipetant à une extrémité et en faisant sortir doucement le liquide à l'autre extrémité à l'aide d'un mouchoir Kim. Piéger optiquement une bille en suspension et la placer en contact avec l'extrémité libre d'une cellule. Rincer à nouveau la chambre à l'aide d'une micropipette et d'un mouchoir Kim blanc avec 50 microlitres de céphalexine dans du LB afin d'éliminer les billes non fixées. Ensuite, exécuter un programme personnalisé sous LabVIEW afin d'appliquer des forces de flexion à la cellule et d'enregistrer les données de déplacement induit par la force.

Tout d'abord, étalonner la réponse du détecteur en effectuant un balayage RA de la perle fixée dans le faisceau laser de détection et en enregistrant les signaux de tension PSD 3D. Ensuite, identifier l'axe longitudinal de la cellule sur une image microscopique. Après avoir déterminé l'axe longitudinal de la cellule, déplacer la cellule par paliers dans une direction perpendiculaire à cet axe, tout en déplaçant la cellule, enregistrant la distance parcourue et le déplacement de la perle par rapport au centre du piège optique.

Enfin, convertir les valeurs de déplacement en force appliquée à l’aide de la rigidité du piège mesurée précédemment, puis enregistrer. Le déplacement de la pointe et la force enregistrés dans le fichier constituent les données de déplacement forcé pour une cellule unique. La pente de cette droite correspond à la rigidité en flexion de la cellule.

Nous venons de vous montrer comment associer la rigidité en flexion d'E. coli à un piège optique. Lorsque vous utilisez cette procédure, il est important de vous souvenir de trouver une bonne cellule possédant une extrémité bien définie fixée et une extrémité libre. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.