Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique
April 26th, 2010
Nous présentons un protocole pour le pliage des cellules bactériennes filamenteuses attaché à une surface lamelle avec un piège optique pour mesurer la rigidité de flexion cellulaires.
Afin de déterminer la rigidité à la flexion des cellules coli individuelles, il faut d’abord faire croître les bactéries jusqu’à la phase exponentielle, puis les fixer à une surface de lamelle traitée chimiquement. Laissez les cellules déjà attachées à la surface se développer davantage afin qu’elles développent des extrémités flexibles. Ensuite, coulez des billes diélectriques, piégez une bille et pliez-la à l’extrémité flexible d’une cellule.
La dernière étape de la procédure consiste à plier la cellule avec le piège optique et à mesurer les données de déplacement forcé résultantes. La rigidité en flexion de la cellule peut être calculée par un ajustement linéaire aux données de déplacement forcé. Bonjour, je m’appelle Steven Wong et je travaille dans le laboratoire du professeur Joshua Shere à l’Institut Louis Sickler de génomique intégrative et au Département de physique de l’Université de Princeton.
Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de flexion de cellules écologiques individuelles et la rigidité cellulaire associée. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les contributions de différentes structures intracellulaires à l’intégrité mécanique des cellules bactériennes. Alors commençons.
Pour commencer cette procédure, cultivez trois millilitres de n’importe quelle cellule E coli en phase moyenne à exponentielle. Une fois que les cellules atteignent une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,2 et 0,4, complétez la culture avec 50 microgrammes par millilitre de céphalexine pendant 15 minutes pour induire une croissance filamenteuse. Pendant ces 15 minutes, faites une chambre d’écoulement.
Fixez deux morceaux de ruban adhésif double face avec un espace de trois millimètres entre les morceaux à une lame de verre et collez une lamelle sur le dessus. L’espace entre les morceaux de ruban crée un canal pour l’écoulement du liquide. Enduire la lamelle de PEI en faisant couler 10 microlitres de polyétaline à 1 % dilué dans de l’eau dans la chambre d’écoulement à l’aide d’une micropipette et incuber pendant cinq minutes.
Ensuite, lavez en faisant couler 200 microlitres d’eau à une extrémité de la chambre et en recueillant à l’autre extrémité avec un vide. Après 15 minutes de croissance de la bactérie en présence de céphalexine, faites tourner un millilitre de cellules dans une micro-centrifugeuse et remettez en suspension dans 200 microlitres de LV avec de la céphalexine. Ensuite, encore une fois, utilisez une micro-pipette à une extrémité et passez sous vide à l’autre extrémité pour faire couler 50 microlitres de la culture cellulaire concentrée dans la chambre contenant la lamelle enrobée incubée pendant trois minutes.
Laver ensuite avec 50 microlitres de Vel B complété par de la céphalexine. Pour retirer les cellules non attachées, incubez la chambre à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure pour permettre aux cellules attachées de se développer avant de les placer sur l’instrument de piégeage optique pendant que les cellules sont en incubation. Préparez des billes recouvertes de polylysine en incubant trois microlitres de billes de polystyrène de 0,5 micromètre de diamètre dans l’une de polylysine à 0,1 % diluée dans de l’eau pendant 30 minutes.
Lorsque les billes ont fini d’incuber, lavez-les trois fois en les faisant tourner dans une micro-centrifugeuse et mettez-les en suspension dans un millilitre d’eau, procédez à la liaison des billes aux bactéries et mesurez la rigidité de liaison des cellules. L’aspect le plus difficile de ce protocole est de pouvoir reconnaître, localiser et reconnaître une bonne cellule pour les mesures de flexion, de rigidité. Et une bonne cellule est une cellule avec une extrémité collée bien définie et une extrémité libre Place.
La chambre d’écoulement du microscope recherche une cellule avec une extrémité coincée bien définie. Certaines cellules sont attachées juste à une pointe, et la force de flexion à l’autre pointe conduit à ce qu’une cellule entière pivote plutôt qu’à la flexion. Pour trouver une cellule appropriée, pliez rapidement chaque cellule avec le piège en utilisant le mouvement de platine contrôlé par le joystick.
Lorsqu’une cellule appropriée est trouvée, diluez la solution de billes d’un facteur deux en lb avec de la céphalexine, ajoutez 30 microlitres de la solution de billes dans la chambre d’écoulement en pipetant à une extrémité et en s’écoulant doucement à l’autre extrémité avec un chiffon Kim Towel Towel piège optiquement une bille flottante et touche-la à l’extrémité libre d’une cellule. Lavez à nouveau la chambre à l’aide d’une micropipette et à l’aide d’un mouchoir en papier blanc Kim avec 50 microlitres de céphalexine dans LB pour retirer les billes détachées. Ensuite, exécutez un programme de vue de laboratoire écrit personnalisé pour appliquer des forces de flexion à la cellule et enregistrer les données de déplacement forcé.
Tout d’abord, calibrez la réponse du détecteur en balayant la perle attachée dans le faisceau laser de détection et en enregistrant les signaux de tension 3D PSD. Identifiez ensuite l’axe long de la cellule sur une image microscope. Après avoir identifié l’axe de la cellule longue, déplacez la cellule par pas dans une direction perpendiculaire à l’axe long tout en déplaçant l’enregistrement de la cellule, la distance parcourue et le déplacement de la perle par rapport au centre du piège optique.
Enfin, convertissez les valeurs de déplacement en force appliquée à l’aide de la rigidité du piège précédemment mesurée et enregistrez. Le déplacement de la pointe et la force de limer sont ici des données de déplacement forcé pour une seule cellule. La pente de cette ligne est la rigidité en flexion de la cellule.
Nous venons de vous montrer comment marier la rigidité en flexion d’E coli avec un piège optique. Lors de l’utilisation de cette procédure, il est important de ne pas oublier de trouver une bonne cellule avec une extrémité collée et une extrémité libre bien définies. Donc c’est tout.
Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.
Aperçu
Cet article présente un protocole pour mesurer la rigidité en flexion des cellules bactériennes filamenteuses en utilisant des techniques de piégeage optique. La méthode implique la culture de cellules E. coli, leur fixation sur un porte-objets et l'application de forces de flexion pour évaluer leurs propriétés mécaniques.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biophysique
- Mécanique cellulaire
Contexte
- Comprendre les propriétés mécaniques des cellules bactériennes est crucial pour obtenir des informations sur leur comportement et leur intégrité.
- La croissance filamenteuse de E. coli peut être induite pour étudier leur rigidité en flexion.
- Les pièges optiques fournissent une méthode non invasive pour appliquer des forces sur des cellules individuelles.
- Les études précédentes se sont concentrées sur l'intégrité mécanique des cellules dans diverses conditions.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole fiable pour mesurer la rigidité en flexion des cellules E. coli.
- Investiguer les contributions des structures intracellulaires à la mécanique cellulaire.
- Améliorer la compréhension du comportement des cellules bactériennes sous contrainte mécanique.
Méthodes utilisées
- Cultiver des cellules E. coli dans un milieu LB jusqu'à la phase exponentielle.
- Induire une croissance filamenteuse à l'aide de céphalexine.
- Fixer les cellules sur un porte-objets traité chimiquement.
- Utiliser des pièges optiques pour appliquer des forces de flexion et mesurer les données de déplacement.
Résultats principaux
- Le protocole mesure avec succès la rigidité en flexion des cellules E. coli individuelles.
- L'analyse des données révèle la relation entre la force appliquée et le déplacement des cellules.
- L'identification des cellules appropriées pour la mesure est cruciale pour des résultats précis.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la mécanique des cellules bactériennes.
Conclusions
- Le protocole développé est efficace pour étudier les propriétés mécaniques des cellules bactériennes.
- Le piégeage optique est un outil précieux pour étudier la rigidité cellulaire.
- Les études futures peuvent s'appuyer sur ces résultats pour explorer d'autres aspects de la mécanique cellulaire.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
