Name: Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Découvrez comment mesurer la rigidité à la flexion des cellules bactériennes E. coli en utilisant un piège optique. Cette méthode permet d'étudier les propriétés mécaniques cellulaires et les contributions des structures intracellulaires.

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Nous reconnaissons des conseils utiles à partir Mingzhai Soleil sur les cellules se liant à des surfaces. Nous remercions Ned Wingreen et Zemer Gitai des discussions utiles. Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé accorde P50GM07150, la National Science Foundation bourse de carrière PHY-0844466 et la Alfred P. Sloan Foundation.

<ol><li> Cultiver des cellules de E. coli dans Luria-Beltrani bouillon (LB) à la phase exponentielle (DO = 0,2-0,4). </li><li> Cultiver la culture en milieu LB supplémenté avec 50 ug / ml de céphalexine pendant 15 min pour induire la croissance filamenteuse, et ensuite se concentrer à la culture de 5 fois par centrifugation. </li><li> Faire PEI enduit de lamelle en s'écoulant polyéthylènimine 1% dilué dans de l'eau dans une chambre de flux, et laver avec de l'eau après une incubation de 5 minutes. </li><li> Débit de la culture de cellules concentrées dans la chambre, et on les lave avec un mélange de LB et céphalexine (50μg/mL) après 3 min pour éliminer les cellules seules. </li><li> Incuber la chambre à 37 ° C pendant 30 min-1 heure pour laisser les cellules attachées croître avant le placement sur l'instrument piégeage optique. </li><li> Faire polylysine billes recouvertes par l'incubation des billes de polystyrène de 0,5 um de diamètre (Bangs Labs) dans la polylysine 0,1% dilué dans l'eau pendant 30 min. Puis laver les billes de 3 fois et remettre en suspension dans l'eau. </li><li> Diluer la solution bourrelet par un facteur de deux dans la LB avec céphalexine (50μg/mL), et l'ajouter dans la chambre de flux. </li><li> Optiquement piéger un flottant de perles et le toucher à l'extrémité libre d'une cellule. (Nous utilisons un Mad Labs Ville piézo scène pour le contrôle du mouvement de l'échantillon.) Quand une combinaison appropriée billes / cellule est trouvée, laver la chambre avec céphalexine dans LB (50μg/mL) pour enlever les perles seules. </li><li> Exécutez le programme personnalisé écrite LabView pour appliquer des forces de flexion à la cellule et d'enregistrer force-déplacement de données. Détails du programme <ol class="lalpha"><li> Calibrer la réponse du détecteur à balayage par trame le talon ci-joint dans le faisceau laser de détection et d'enregistrement des signaux de tension 3D PSD. </li><li> Identifier les axes de cellules longues à l'image de microscope. </li><li> Déplacer des cellules dans les étapes dans une direction perpendiculaire à l'axe de la cellule de long. </li><li> Enregistrement la distance parcourue et le déplacement de la trappe optique. </li><li> Convertir un déplacement à la force appliquée à l'aide de la raideur piège précédemment mesuré et enregistrer le déplacement pointe et la force de déposer. </li></ol></li></ol> Les secrets du succès: Dans l'étape 8), on a besoin de trouver une cellule avec une fin bien définis coincé. Certaines cellules sont simplement bloqué à un bout, et la force de flexion à l'extrémité d'autres conduit à un pivotement de cellules entières plutôt que de plier. Une paire convenable soit trouvé en pliant chaque cellule rapidement à la main utilisant la motion à l'étape manette contrôlée. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="Figure 1"> Figure 1. Cette figure montre force-déplacement des données pour une seule cellule. La pente de cette ligne est la rigidité à la flexion de la cellule.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

Le protocole présenté ici est conçu pour mesurer quantitativement les propriétés de flexion des cellules bactériennes. La configuration de test peut être appliqué à n&#39;importe quelle cellule en forme de tige qui peut être fait de grandir filamentously. Nous avons utilisé avec succès cette configuration pour sonder les effets des filaments du cytosquelette de la rigidité à la flexion de E. cellules coli. Cette même technique peut être utilisée pour évaluer le rôle de la pression, rigidité de la paroi cellulaire et d&#39;autres composants intracellulaires dans la détermination de l&#39;ensemble rigidité à la flexion des cellules.

<table><tbody><tr><td>céphaléxine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>polyéthylénimine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>polylysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>billes de polystyrène de 0,5-&amp;mu;m de diamètre</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Système de nanopositionnement Nano-LP Series</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Nous avons développé un protocole pour mesurer la rigidité de flexion de filamenteuse en forme de bâtonnets. Les forces sont appliquées avec un piège optique, un microscope en trois dimensions du printemps fait de lumière qui se forme quand un faisceau de haute intensité laser est focalisé sur un très petit point par une lentille de l&#39;objectif du microscope. Pour courber une cellule, nous avons d&#39;abord se lier aux bactéries vivantes d&#39;une lamelle traitée chimiquement. Comme ces cellules se développent, au milieu des cellules est liée à la lamelle, mais les extrémités sont libres de plus en plus de cette contrainte. En induisant la croissance filamenteuse avec la céphalexine drogue, nous sommes en mesure d&#39;identifier les cellules dans laquelle une extrémité de la cellule a été collé à la surface tandis que l&#39;autre extrémité est restée seules et sensibles aux forces de flexion. A force de flexion est ensuite appliqué avec un piège optique en se liant d&#39;un cordon polylysine enduits à la pointe d&#39;une cellule en croissance. La fois la force et le déplacement de la bille sont enregistrées et la rigidité en flexion de la cellule est la pente de cette relation.

Nous présentons un protocole pour le pliage des cellules bactériennes filamenteuses attaché à une surface lamelle avec un piège optique pour mesurer la rigidité de flexion cellulaires.

Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique

Nous avons développé un protocole pour mesurer la rigidité à la flexion de bactéries filamenteuses en forme de bâtonnets. Des forces sont appliquées à l'aide d'un piège optique, un dispositif microscopique...

Afin de déterminer la rigidité à la flexion de cellules individuelles de coli, commencez par cultiver les bactéries jusqu'à la phase exponentielle, puis fixez-les sur une lame recouverte d'un support chimiquement traité. Laissez les cellules déjà attachées à la surface poursuivre leur croissance afin qu'elles développent des extrémités flexibles. Ensuite, introduisez des billes diélectriques par écoulement, piégez une bille et courbez-la jusqu'à l'extrémité flexible d'une cellule.La dernière étape de la procédure consiste à courber la cellule à l’aide du piège optique et à mesurer les données de déplacement induit qui en résultent. La rigidité en flexion de la cellule peut être calculée par un ajustement linéaire des données de déplacement induit. Bonjour, je suis Steven Wong du laboratoire du professeur Joshua Shere à l’Institut Louis Sickler de génomique intégrative et du Département de physique de l’Université de Princeton.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de flexion de cellules bactériennes individuelles et de mesure de la rigidité cellulaire. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la contribution des différentes structures intracellulaires à l'intégrité mécanique des cellules bactériennes. Commençons donc.Pour commencer cette procédure, faire croître trois millilitres de cellules d’E. coli quelconques en milieu LB jusqu’à la phase exponentielle. Une fois que les cellules atteignent une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,2 et 0,4, compléter la culture avec 50 microgrammes par millilitre de céphalexine pendant 15 minutes afin d’induire une croissance filamenteuse. Pendant ces 15 minutes, préparer une chambre d’écoulement.Fixez deux morceaux de ruban adhésif double face avec un espace de trois millimètres entre eux sur une lame de verre, puis fixez une lamelle par-dessus. L'espace entre les morceaux de ruban adhésif crée un canal pour l'écoulement du liquide. Recouvrez la lamelle de PEI en faisant circuler 10 microlitres de polyéthylène à 1 % dilué dans l'eau dans la chambre d'écoulement à l'aide d'une micropipette, puis incubez pendant cinq minutes.Ensuite, effectuez un lavage en faisant circuler 200 microlitres d'eau à une extrémité de la chambre et en recueillant à l'autre extrémité à l'aide d'un vide. Après 15 minutes de croissance des bactéries en présence de céphalexine, centrifugez un millilitre de cellules dans une microcentrifugeuse et remettez en suspension dans 200 microlitres de LV contenant de la céphalexine. Ensuite, utilisez à nouveau une micropipette à une extrémité et le vide à l'autre extrémité pour faire circuler 50 microlitres de la culture cellulaire concentrée dans la chambre contenant le coverslip revêtu, puis incubez pendant trois minutes.Ensuite, lavez avec 50 microlitres de Vel B supplémenté en céphaléxine. Pour éliminer les cellules non attachées, incubez la chambre à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure afin de permettre la croissance des cellules attachées avant de les placer sur l'instrument de piégeage optique, pendant l'incubation des cellules. Préparez les billes revêtues de polylysine en incubant trois microlitres de billes de polystyrène de 0,5 micromètre de diamètre dans une solution de polylysine à 0,1 % diluée dans l'eau pendant 30 minutes.Lorsque l'incubation des billes est terminée, lavez-les trois fois en les centrifugeant dans une microcentrifugeuse, puis en les resuspendant dans un millilitre d'eau. Procédez ensuite à la liaison des billes aux bactéries et mesurez la rigidité de liaison des cellules. L'aspect le plus délicat de ce protocole consiste à pouvoir récupérer, localiser et reconnaître une cellule adéquate pour les mesures de flexion et de rigidité. Une bonne cellule est une cellule dont l'extrémité fixée et l'extrémité libre sont bien définies.Sur la chambre d'écoulement du microscope, recherchez une cellule présentant une extrémité bien définie et fixée. Certaines cellules ne sont attachées qu'à une seule de leurs extrémités, et la force de flexion à l'autre extrémité provoque une rotation complète de la cellule plutôt qu'une flexion. Pour trouver une cellule appropriée, fléchissez rapidement chaque cellule à l'aide du piège en utilisant le déplacement de la platine contrôlé par le joystick.Lorsqu'une cellule appropriée est trouvée, diluer la solution de billes d'un facteur deux dans du lb contenant de la céphalexine, puis ajouter 30 microlitres de la solution de billes dans la chambre d'écoulement en pipetant à une extrémité et en faisant sortir doucement le liquide à l'autre extrémité à l'aide d'un mouchoir Kim. Piéger optiquement une bille en suspension et la placer en contact avec l'extrémité libre d'une cellule. Rincer à nouveau la chambre à l'aide d'une micropipette et d'un mouchoir Kim blanc avec 50 microlitres de céphalexine dans du LB afin d'éliminer les billes non fixées. Ensuite, exécuter un programme personnalisé sous LabVIEW afin d'appliquer des forces de flexion à la cellule et d'enregistrer les données de déplacement induit par la force.Tout d'abord, étalonner la réponse du détecteur en effectuant un balayage RA de la perle fixée dans le faisceau laser de détection et en enregistrant les signaux de tension PSD 3D. Ensuite, identifier l'axe longitudinal de la cellule sur une image microscopique. Après avoir déterminé l'axe longitudinal de la cellule, déplacer la cellule par paliers dans une direction perpendiculaire à cet axe, tout en déplaçant la cellule, enregistrant la distance parcourue et le déplacement de la perle par rapport au centre du piège optique.Enfin, convertir les valeurs de déplacement en force appliquée à l’aide de la rigidité du piège mesurée précédemment, puis enregistrer. Le déplacement de la pointe et la force enregistrés dans le fichier constituent les données de déplacement forcé pour une cellule unique. La pente de cette droite correspond à la rigidité en flexion de la cellule.Nous venons de vous montrer comment associer la rigidité en flexion d'E. coli à un piège optique. Lorsque vous utilisez cette procédure, il est important de vous souvenir de trouver une bonne cellule possédant une extrémité bien définie fixée et une extrémité libre. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

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Beaucoup de protéines dans la cellule détecte et induire la courbure de la membrane. Les auteurs décrivent une méthode pour extraire des nanotubes de la membrane de vésicules lipidiques pour étudier l’interaction des protéines ou de n’importe quelle molécule de courbure-active avec courbes de membranes in vitro.

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Ce protocole vise à automatiser les mesures AFM sur des centaines de cellules microbiennes. Tout d’abord, les microbes sont immobilisés dans des microstructures de tampon PDMS, puis des mesures de spectroscopie de force sont effectuées automatiquement sur des centaines de cellules immobilisées.

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Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique

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