Extraction mécanique du chorion et de la membrane vitelline : une méthode pour préparer les ovocytes de drosophile à l’observation directe

- Commencez par des ovocytes matures d’ovaires fixes dans une solution saline. Les ovocytes matures portent des coquilles d’œufs composées d’un chorion externe et d’une membrane vitelline interne.

Pour retirer mécaniquement le chorion et la membrane vitelline, placez les ovocytes entre les parties givrées de deux lames prétraitées. Déplacez la glissière supérieure dans des mouvements droits d’avant en arrière pour créer une friction qui roule les ovocytes.

Maintenant, déplacez la glissière supérieure légèrement inclinée pour faire rouler les ovocytes dans une autre direction. En évitant les mouvements circulaires, augmentez cet angle par petits incréments jusqu’à ce que la glissière supérieure se déplace perpendiculairement à la glissière inférieure. Ce mouvement permet d’enlever mécaniquement les chorions et les membranes vitellines, permettant l’accès des sondes ou des taches dans l’ovocyte.

Les ovocytes sans chorions apparaîtront longs et minces, et ceux sans membranes vitellines auront des extrémités pointues. Pour séparer les ovocytes éliminés des débris environnants, transférez le mélange d’échantillons dans un tube et laissez les ovocytes se déposer vers le bas tandis que les débris flottent vers le haut et peuvent être retirés.

Dans ce protocole, nous allons retirer les membranes chorioniques et vitellines des ovocytes matures de drosophile.

- Pour séparer les ovocytes à un stade avancé, ajoutez d’abord 1 millilitre de PBSBTx dans une boîte de dissection peu profonde. Ensuite, utilisez un P200 avec un embout recouvert de BSA pour transférer les ovaires fixes dans la boîte peu profonde. Pipetez les ovaires de haut en bas avec l’embout de pipette recouvert de BSA pour déloger les ovocytes matures des ovocytes moins matures.

Lorsque les ovocytes à un stade avancé sont suffisamment séparés, transférez tout le tissu dans un tube à microfuge de 500 microlitres. Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette Pasteur tirée, en laissant environ 150 à 200 microlitres dans le tube.

Pour préparer le roulage des ovocytes, pré-mouillez un plat profond avec 200 microlitres de PBSBTx. Couvrez le plat et mettez-le de côté.

Obtenez trois lames de verre dépoli et mettez la troisième diapositive de côté. Ensuite, frottez doucement les régions de verre dépoli des lames un et deux ensemble. Rincez-les à l’eau déminéralisée pour enlever les éclats de verre et séchez-les avec une lingette jetable. Enduire les régions givrées des lames un et deux avec PBSBTx en ajoutant 50 microlitres de PBSBTx à une lame et en frottant cette région avec l’autre lame. Retirez le liquide à l’aide d’une lingette jetable et placez les lames sous un microscope à dissection. Gardez les zones givrées des diapositives un et deux en contact avec la diapositive trois supportant la diapositive deux.

Pour rouler les ovocytes, il faut d’abord pré-mouiller une pointe de pipette P200 dans du PBSBTx et disperser les ovocytes dans le tube de microfuge en pipetant de haut en bas. Transférez 50 microlitres de liquide contenant les ovocytes au centre de la partie en verre dépoli de la première lame. Soulevez la glissière deux pour ce faire.

Abaissez lentement la glissière deux jusqu’à ce que la tension superficielle du liquide crée un joint entre les deux régions de verre dépoli. Il devrait y avoir suffisamment de liquide pour couvrir la zone givrée, mais aucun ne devrait s’échapper. Ensuite, tenez la glissière inférieure en place d’une main et utilisez l’autre main pour déplacer la glissière supérieure deux d’avant en arrière dans une direction horizontale, en maintenant la glissière deux à niveau et soutenue sur la diapositive trois.

Effectuez sous un microscope pour une visualisation facile des mouvements et de la progression des ovocytes. Après quelques mouvements dans le sens horizontal, modifiez légèrement l’angle de mouvement. Par incréments multiples, augmentez progressivement cet angle à 90 degrés jusqu’à ce que le mouvement de la glissière supérieure deux soit perpendiculaire à la direction de départ. Notez que des chorions vides seront visibles dans le liquide, et que les ovocytes dépourvus de chorions apparaîtront plus longs et plus minces.

- Lorsque vous roulez les ovocytes, assurez-vous que le sens de roulement est toujours en ligne droite et jamais en mouvement circulaire.

- Répétez le roulement environ 7 à 10 fois jusqu’à ce que la solution devienne légèrement trouble. Arrêtez de rouler lorsque la majorité des ovocytes semblent avoir perdu leurs membranes vitellines.

Soulevez doucement la diapositive supérieure deux, en faisant glisser l’un de ses coins vers le centre de la région givrée au bas de la diapositive un afin que les ovocytes roulés s’accumulent au centre de la région givrée. Rincez les ovocytes des deux lames avec PBSBTx dans la boîte à puits profond contenant PBSBTx.

Nettoyez les lames un et deux avec de l’eau ultra-pure. Sécher avec une lingette jetable et réinitialiser. Répétez ces étapes jusqu’à ce que tous les ovocytes du même génotype aient été roulés. Cela nécessite généralement trois à quatre cycles de roulement par génotype.

Pour enlever les débris après le roulage, ajoutez 1 millilitre de PBSBTx dans un tube conique de 15 millilitres. Faites tourbillonner le liquide pour enrober les côtés du tube. À l’aide d’une pointe de pipette P1000 recouverte de PBSBTx, transférez les ovocytes roulés de la boîte à puits profond dans le tube conique contenant 1 millilitre de PBSBTx. Ajoutez 2 millilitres supplémentaires de PBSBTx dans le tube conique contenant les ovocytes.

Tenez le tube conique contre un fond sombre pour voir les ovocytes opaques pendant qu’ils coulent. Après avoir laissé les ovocytes se déposer au fond, utilisez un P1000 pour retirer les 2 millilitres supérieurs de solution contenant des débris et jetez-les.

Après avoir répété l’étape pour un total de trois cycles d’élimination des débris, utilisez une pointe de pipette P1000 recouverte de PBSBTx pour transférer les ovocytes dans le tube de microfuge d’origine de 500 microlitres. 20 à 25 femelles devraient produire environ 50 microlitres d’ovocytes matures roulés.