Drosophile In Vivo L’imagerie calcique : une méthode d’imagerie fonctionnelle de l’activité neuronale

- Pour réaliser une imagerie calcique in vivo dans le système nerveux de la drosophile, ciblez l’expression d’un indicateur calcique génétiquement codé, tel que GCaMP, vers les neurones d’intérêt. Lorsque les neurones déclenchent un potentiel d’action, la dépolarisation rapide de la membrane provoque l’ouverture de canaux calciques voltage-dépendants, entraînant un afflux de calcium extracellulaire dans la cellule.

GCaMP est une protéine de fusion dans laquelle la protéine fluorescente verte améliorée, ou EGFP, est modifiée et fusionnée avec le fragment M13 de la chaîne légère de la myosine à l’extrémité N-terminale, et avec la protéine de liaison au calcium, la calmoduline, à l’extrémité C-terminale. Le calcium se lie à la calmoduline, déclenche des changements de conformation dans le GCaMP, provoquant une augmentation de la fluorescence de la protéine.

Pour imager les changements de fluorescence de GCaMP en tant qu’indicateur de l’activité neuronale in vivo, exposez la région du système nerveux avec l’activité anticipée. Ensuite, utilisez un microscope fluorescent capable de capturer la dynamique du GCaMP et équipé d’une configuration de distribution de stimulus. Délivrer le stimulus, par exemple, une odeur, tout en enregistrant la fluorescence GCaMP dans les neurones répondants.

Dans l’exemple de protocole, nous verrons l’imagerie fonctionnelle GCaMP utilisée pour visualiser les réponses dans les corps champignon du cerveau pendant l’apprentissage associatif olfactif.

- Pour la visualisation des indicateurs calciques basés sur la GFP, régler le laser d’un microscope multiphotonique équipé d’un laser infrarouge et d’un objectif à immersion dans l’eau, installé sur une table isolée des vibrations, à une longueur d’onde d’excitation de 920 nanomètres, et installer un filtre passe-bande GFP. À l’aide du bouton de réglage Z grossier, balayez l’axe z du cerveau pour localiser la région cérébrale d’intérêt. Utilisez la fonction de recadrage pour concentrer le balayage uniquement sur la zone d’intérêt afin de minimiser le temps de balayage, et faites pivoter la vue de balayage de sorte que la partie antérieure de la tête soit tournée vers le bas. Ensuite, ajustez la taille de l’image à 512 x 512 pixels et sélectionnez la région à numériser, en tenant compte du temps de balayage calculé pour chaque image afin d’atteindre une fréquence d’images d’au moins 4 Hertz.

Pour la visualisation des transitoires calciques évoqués par les odeurs, lancez un macro-package préprogrammé capable de relier le logiciel d’acquisition d’images et le programme de diffusion des odeurs et commencez la mesure dans le logiciel du microscope pendant 6,25 secondes pour établir une valeur de référence F0. Dans le système de diffusion des odeurs, délivrez un stimulus d’odeur de 2,5 secondes, indiqué ici par l’allumage des LED, déclenché par l’ouverture et la fermeture de vannes de coupelle d’odeur spécifiques, suivi de 12,5 secondes d’enregistrement à la fin du décalage d’odeur. Ensuite, répétez l’administration pour un deuxième et un troisième odorant de la même manière.

Pour effectuer un conditionnement associatif dans cette configuration, utilisez le système de diffusion d’odeurs contrôlé par ordinateur pour présenter le stimulus conditionné plus l’odeur pendant 60 secondes, ainsi que 12 chocs électriques de 90 volts. Après une pause de 60 secondes, présentez le stimulus de la condition moins l’odeur seule pendant 60 secondes sans choc électrique. Mesurez à nouveau les transitoires calciques évoqués par les odeurs après l’entraînement en répétant le protocole de stimulation des odeurs avant l’entraînement 3 minutes après la fin de la phase d’entraînement. Ensuite, enregistrez les fichiers d’imagerie dans un format approprié pour une analyse ultérieure des images.