Name: Une étape métabolomique: glucides, acides organiques et aminés quantifiés dans une procédure unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez une procédure métabolomique en une étape pour quantifier glucides, acides organiques et aminés par GC/MS. Cette méthode améliore le dépistage néonatal en identifiant 38% de maladies génétiques supplémentaires non détectées par spectrométrie de masse en tandem.

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L&#39;assistance technique de mesure Anthony Thomas est grandement appréciée.

Procédure de traitement des échantillons d&#39;urine <ol><li> Décongeler les échantillons d&#39;urine dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Décanter dans un nouveau récipient si l&#39;original est compromise. </li><li> Prélever une partie aliquote maximum de 13 ml d&#39;échantillon et de le stocker à -20 ° C dans un tube à centrifuger conique étiquetés. </li><li> Mesurer et noter la densité optique de l&#39;échantillon en plaçant quelques gouttes d&#39;urine dans le réfractomètre. </li><li> Filtrer l&#39;échantillon à travers un filtre de 0,2 um. </li><li> Mesurez le volume d&#39;échantillon ci-dessous en fonction de la densité optique <table border="0"><tbody><tr><td> De 1.000 à 1.009 </td><td> 1,00 ml </td></tr><tr><td> De 1.010 à 1.019 </td><td> 0,50 ml </td></tr><tr><td> 1.020 à 1.050 </td><td> 0,25 ml + 0,25 ml de H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> Le volume spécifié est ensuite transféré dans un contenant Reactivial les normes internes suivants: 500 nanomoles (nmoles) 3 créatine; 10 nmoles d 3 acide méthylmalonique; 100 nmoles chacun des 13 suivantes C 3 lactate, pyruvate 13 C 3, C 13 2 15 N glycine, sérine D 3, D 5 phénylalanine, D 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, d 4 acide sébacique, 13 C 6 du glucose, d 6 inositol et d 5 tryptophane. </li><li> 20 microlitres (ul) d&#39;un 7,5 unités / ul solution d&#39;uréase (Calzyme Laboratoires catalogue no. 116A0100) est ajoutée à l&#39;échantillon, qui est ensuite rincé et scellés sous CO 2 grâce à un septum inerte. </li><li> L&#39;échantillon est maintenu à 37 ° C pendant 30 minutes avec du gaz carbonique plus de dioxyde ajoutés à intervalles de 15 minutes pour maintenir la pression. </li><li> 20 ul de la solution de plusieurs uréase est ajouté, le flacon est rincé avec du dioxyde de carbone, et l&#39;échantillon maintenu à 37 ° C pendant 15 minutes. </li><li> 500 ul d&#39;acétone 30:70: méthanol est ajouté, le septum en caoutchouc est remplacé par un septum en téflon enduit, et l&#39;échantillon est refroidi à -20 ° C pendant 15 minutes. </li><li> Les solides sont éliminés par centrifugation à 1500 rpm x 10 minutes puis décanté dans un endroit propre Reactivial 2,0 cc (Supelco / Sigma) </li><li> Ajouter trifluoroacétate triéthylammonium (TEA / TFA) (Sigma) comme suit: <ul><li> 20 ul de 1,00 ml d&#39;échantillons </li><li> 40 ul de 0,5 ml, ou moins, des échantillons </li></ul></li><li> Terminez avec de l&#39;acétonitrile et le lieu sous un flux d&#39;azote à 70 ° C jusqu&#39;à un volume constant est réalisé (TEA / TFA restera) (~ 15 minutes). </li><li> Répétez l&#39;étape 13, jusqu&#39;à 4 fois jusqu&#39;à ce que se forme un précipité (~ 10 minutes chacun). </li><li> Laisser refroidir pendant environ 2 minutes. Terminez avec le chlorure de méthylène, en prenant soin de déborder, et sec (~ 4h00 minutes). </li><li> Répétez l&#39;étape 15. </li><li> Ajouter MSTFA (N-méthyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (thermique scientifique) aux taux suivants: <ul><li> 150 ul d&#39;échantillons 1,00 ml </li><li> 200 pi de 0,50 ml ou moins, des échantillons </li></ul></li><li> Cap sous atmosphère d&#39;azote et incuber à 70 ° C pendant 1 heure. </li><li> Transfert à microtubes, sous atmosphère d&#39;azote, pour une analyse sur le chromatographe en phase gazeuse / spectromètre de masse. </li><li> Microtubes place pour injection automatisée par le CPG Agilent 5975 / MS: les températures sont Instrument: injecteur 200 ° C, une interface 250 ° C, four à 80 ° C pendant 1 minute; rampe à 4 ° C / minute 80-130 ° C, rampe à 6 ° C / minute de 130 à 200 ° C, d&#39;une rampe à 12 ° C / minute de 200 à 285 ° C, maintenir pendant 10 minutes. Colonne: 25 m, 320 microns d&#39;identité, 0,5 microns d&#39;épaisseur du film DB-5. Spectrométrie de masse: la source de 230 ° C, quad 150 ° C, de numérisation de 50 à 650 uma à 2,46 scans / sec. Solvant délai de 3,5 minutes. </li></ol> Les résultats représentatifs S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">cliquez ici</a> pour voir les résultats représentatifs.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

Le Laboratoire de dépistage métabolique est un laboratoire CLIA licence cliniques détenue par Saint Louis University, une corporation sans but lucratif. Cordonnier Dr ne profite pas directement à partir des recettes de laboratoire, mais peut bénéficier indirectement de la productivité du laboratoire. Aucune des méthodes, des techniques, des résultats, des fourchettes normales, des macros, des logiciels, des bibliothèques ou des conclusions sont considérés comme propriétaires et sont librement disponibles aux parties intéressées.

La méthode uréase (1) a été cité 62 fois dans la littérature médicale avec diverses modifications. Groupe de Matsumoto (2,3) a simplifié la procédure de criblage à haut débit néonatale et a rapporté les résultats de 16000 patients. Kuhara et d&#39;autres (4-7) ont rapporté l&#39;utilisation de la méthode dans plusieurs cas de diagnostic d&#39;erreur innée et de suivi. Rhead (8) a également confirmé l&#39;utilité de la méthode pour le diagnostic clinique et le suivi des erreurs innées. La méthode a été appliquée à l&#39;urine de l&#39;ours, souris knock-out, des éléphants et des homogénats de mouches des fruits entiers et leurs larves (9). Les milieux de culture de Cryptococcus avant et après la mutagenèse dirigée ont également été analysés, sans l&#39;étape uréase (10). La méthode a été appliquée à l&#39;évaluation nutritionnelle des étudiants en médecine humaine, Bas patients présentant un syndrome démentiel et des anciens combattants âgés après le chargement des sujets avec des doses orales des acides aminés tryptophane, la méthionine et l&#39;isoleucine (11). Tous les huit vitamines B ont été évaluées par la quantification des produits de dégradation des trois acides aminés qui, parmi eux, exigent que tous les 8 vitamines à un moment de leur dégradation. Les effets toxiques des produits pharmaceutiques et leur atténuation par la supplémentation en vitamine A a été signalé (12). Échantillons de liquide amniotique de grossesses normales du syndrome de Down et ont été analysées et rapportées (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Ordinateur</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Ordinateur</td></tr><tr><td>Uréase</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>Aussi Sigma C3</td></tr><tr><td>Étalon isotopique stable</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solvants</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de GC</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>Vials</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Joint d'étanchéité Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

une étape métabolomique: glucides, acides organiques et aminés quantifiés dans une procédure unique

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Chaque enfant né aux États-Unis est maintenant projeté pour un maximum de 42 troubles génétiques rares appelées «erreurs innées du métabolisme&quot;. La méthode de dépistage est basé sur la spectrométrie de masse en tandem et quantifie acylcarnitines comme un écran pour des acides organiques et des mesures aussi des acides aminés. Tous les états également effectuer des tests enzymatiques pour les troubles des glucides tels que galactosémie. Parce que les résultats peuvent être non spécifiques, des tests de suivi des résultats positifs est nécessaire en utilisant une méthode plus définitive. Le présent rapport décrit les «uréase&quot; méthode de préparation des échantillons pour le dépistage erreur innée. Uréase cristalline est utilisé pour éliminer l&#39;urée à partir des fluides corporels, qui permet la plupart des autres métabolites hydrosolubles pour être déshydratés et transformés en dérivés pour la chromatographie en phase gazeuse dans une procédure unique. La déshydratation par évaporation dans un courant d&#39;azote est facilitée par l&#39;ajout d&#39;acétonitrile et le chlorure de méthylène. Puis, triméthylsilylation a lieu dans la présence d&#39;un catalyseur unique trifluoroacétate triéthylammonium,. D&#39;injection automatisée et est suivie par chromatographie macro-conduit la quantification personnalisées de 192 métabolites et semi-quantification de tous les principaux composants en utilisant des bibliothèques spécialisées des spectres de masse des TMS dérivés des composés biologiques. L&#39;analyse peut être effectuée sur la plate-forme Chemstation largement utilisé en utilisant les macros et les bibliothèques disponibles auprès de l&#39;auteur. Dans notre laboratoire, plus de 16.000 échantillons de patients ont été analysés en utilisant la méthode avec un rendement diagnostique d&#39;environ 17% - soit 17% des résultats des échantillons révèlent conclusions qui doivent être traitées par le médecin traitant. Inclus dans ce sont plus de 180 confirmés erreurs innées, dont environ 38% n&#39;auraient pas pu être diagnostiquée à l&#39;aide des méthodes précédentes.

La méthode d&#39;uréase préparation des échantillons pour analyse GC / MS des métabolites intermédiaires est présenté par son inventeur. La méthode permet en une seule étape de suivi du dépistage néonatal des erreurs innées par spectrométrie de masse en tandem par les glucides quantifier, organiques et d&#39;acides aminés tout dans un seul processus.

Une étape métabolomique: glucides, acides organiques et aminés quantifiés dans une procédure unique

Chaque nourrisson né aux États-Unis fait désormais l'objet d'un dépistage portant sur jusqu'à 42 troubles génétiques rares appelés « erreurs innées du métabolisme ». La méthode de dépistage est basée sur...

Dans cette procédure métabolomique en une seule étape, les échantillons biologiques sont préparés pour l'analyse de glucides, d'acides organiques et d'acides aminés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, en une seule opération. Les échantillons sont d'abord traités avec l'enzyme uréase afin d'éliminer l'urée. La deuxième étape de la procédure consiste à déshydrater les échantillons en présence d'un détergent composé de deux composants volatils, le triathion, l'ammonium et l'acétate de trifluoro.Cela est suivi par la dérivation des composants par triméthylation. Enfin, l'analyse par chromatographie en phase gazeuse, spectrométrie de masse en arbre, la quantification automatisée des glucides, des acides organiques et aminés, de l'isol, de la glycine et des sucres aminés permet de confirmer et de suivre la plupart des troubles génétiques détectés lors du dépistage néonatal, ainsi qu’un supplément de 38 % de troubles non actuellement dépistés par spectrométrie de masse en tandem. Bonjour, je suis Jim Shoemaker au laboratoire de dépistage métabolique de l'Université de Saint-Louis.Je suis ici pour démontrer la métabolomique en une étape, une méthode d'analyse des fluides biologiques destinée à détecter les métabolites intermédiaires sans séparer les composés acides, basiques et neutres. Cela permet de compléter le dépistage néonatal par spectrométrie de masse en tandem avec une seule procédure, qui vous permet d'analyser simultanément les acides organiques, les acides aminés, les glucides, les dérivés des glucides et la glycine ACell. En résumé, sur le graphique derrière moi, vous pouvez constater que les diagnostics indiqués en rouge peuvent être établis grâce à la métabolomique en une étape, mais n'auraient pas été détectés par le dépistage néonatal actuel utilisant la spectrométrie de masse en tandem.Commençons donc la démonstration. Pour commencer cette procédure, placez l'échantillon d'urine dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Si le contenant d'origine est endommagé, transvasez un échantillon dans un nouveau contenant.Prélevez un aliquot d'échantillon et conservez-le à moins 20 degrés Celsius dans un tube conique de centrifugeuse étiqueté, à titre de sauvegarde. Ensuite, mesurez et enregistrez la densité optique de l'échantillon en déposant quelques gouttes d'urine dans le réfractomètre portable. Après la mesure de la densité optique, filtrez l'échantillon à travers un filtre de 0,2 micron.Prélevez le volume d'échantillon en fonction de la densité optique mesurée avant filtration. Pour des valeurs comprises entre 1 et 1,009, utilisez un millilitre d'échantillon ; pour des valeurs comprises entre 1,01 et 1,019, utilisez 0,5 millilitre d'échantillon ; pour des valeurs comprises entre 1,02 et 1,05, mélangez 0,25 millilitre d'échantillon avec 0,25 millilitre d'eau.Transférez le volume spécifié dans un flacon réactif contenant déjà les étalons internes marqués à l'isotope indiqués dans le tableau présenté ici. Les étalons comprennent la créatine, l'acide méthylmalonique, le lactate, le pyruvate, la glycine, la phénylalanine sine, l'hexa oil, la glycine, l'orate, l'acide SEBA, le glucose, l'inositol et le tryptophane. Ajoutez ensuite 20 microlitres d'une solution d'uréase à 7,5 unités par microlitre.Éluer l'échantillon et sceller sous dioxyde de carbone à travers une septum inerte. Conserver l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes tout en ajoutant davantage de gaz dioxyde de carbone à des intervalles de 15 minutes afin de maintenir la pression, à la fin de l'incubation de 30 minutes, à 20 microlitres supplémentaires de la solution d'uréase. Éluer le flacon avec du dioxyde de carbone et maintenir l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant encore 15 minutes.Une fois le traitement par uréase terminé, procédez immédiatement à la déshydratation et à la dérivation de l'échantillon directement après le traitement par uréase. Ajoutez 500 microlitres d'une solution d'acétone à méthanol à raison de 30 à 70. Aux échantillons, remplacez le septum en caoutchouc par un septum revêtu de téflon.Refroidir l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Éliminer les résidus solides par centrifugation à 1500 tr/min pendant 10 minutes, puis transférer le surnageant dans un flacon réactif propre de 2,0 mL. Ajouter ensuite du triammonium trifluoroacétate ou T-E-A-T-F-A, qui constitue le catalyseur de la triméthylation : 20 microlitres pour des échantillons d'un millilitre, et 40 microlitres pour des échantillons de 0,5 millilitre ou moins.Compléter avec de l'acétonitrile et placer sous un courant d'azote à 70 degrés Celsius jusqu'à obtention d'un volume constant, indiquant que seul le T-E-A-T-F-A reste. Cette étape prend environ 15 minutes. Rajouter à nouveau de l'acétonitrile et placer sous un courant d'azote à 70 degrés Celsius jusqu'à stabilisation du volume, répéter jusqu'à quatre fois jusqu'à formation d'un précipité.Cela prend environ 10 minutes à chaque fois après la déshydratation ; laissez refroidir environ deux minutes. Complétez avec du chlorure de méthylène, en prenant soin d'éviter le débordement par ébullition, puis séchez. Cela prend environ quatre minutes.Compléter avec du chlorure de méthylène et sécher. Une fois de plus. Ensuite, dériver l'échantillon.Ajouter 150 microlitres de OFM, STFA pour des échantillons d’un millilitre et 200 microlitres par 0,5 millilitre ou moins. Boucher les échantillons sous une atmosphère d’azote et incuber à 70 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation d’une heure, manipuler sous une atmosphère d’azote pour transférer les échantillons dans des microfioles destinées à une analyse sur un spectromètre de masse couplé à un chromatographe en phase gazeuse ; l’appareil Agilent 5 9 7 5 GCMS est utilisé ici avec une colonne capillaire DB5.Pour la spectrométrie de masse, régler la source à 230 degrés Celsius, le quadripôle à 150 degrés Celsius et la plage de masse balayée à 50 à 650 unités de masse atomique à raison de 2,46 balayages par seconde. Le délai de solvant est de 3,5 minutes. Les températures de l'instrument sont de 200 degrés Celsius pour l'injecteur et de 250 degrés Celsius.Pour l'interface, régler le four à 80 degrés Celsius pendant une minute, puis augmenter de quatre degrés Celsius par minute de 80 à 130 degrés Celsius, ensuite augmenter de six degrés Celsius par minute de 130 à 200 degrés Celsius, et enfin augmenter de 12 degrés Celsius par minute de 200 à 285 degrés Celsius, puis maintenir pendant 10 minutes. Placer les micro-vials contenant les échantillons oculaires dérivés pour une injection automatisée par le GCMS et démarrer l'analyse. Un spectre représentatif d'un échantillon d'urine analysé par GCMS après traitement à l'uréase est montré ici, avec les pics correspondant aux métabolites acide pyroglutamique, acide 4-hydroxycycloacétique et hawkinson marqués.Ces métabolites sont indicatifs de l'anurie de Hawkins, une affection génétique rare. Tous les pics du spectre peuvent être attribués à des métabolites connus et quantifiés. Les résultats des tests initiaux de dépistage néonatal peuvent être non spécifiques.Cependant, les niveaux élevés de métabolites d'UR de Hawkins dans l'échantillon d'urine analysé par GCMS, comme indiqué ici, ont confirmé le diagnostic de cette maladie héréditaire du métabolisme. En utilisant la même méthode URIs, des erreurs innées ont été diagnostiquées chez 184 patients. Près de 40 % des diagnostics indiqués en rouge n'auraient pas été établis par spectrométrie de masse en tandem couramment utilisée dans le dépistage néonatal.Voilà donc notre démonstration de la façon d'effectuer une métabolomique en une seule étape à l'aide de la méthode de l'uréase pour analyser les fluides biologiques en vue de détecter les glucides, les acides organiques et aminés, ainsi que les acylglycines, le tout dans une même procédure. Il est important de se rappeler que lors de l'évaluation de l'efficacité de la procédure, la digestion à l'uréase, la déshydratation et la simulation de la triméthylation peuvent toutes être évaluées quant à leur complétude, simplement en vérifiant la présence de tous les standards internes.Les étalons internes ont été délibérément choisis afin de démontrer, par exemple, que la déshydratation s’était déroulée complètement, car sinon, la créatinine TRI TMS ne serait pas présente en quantité totale. C’est ainsi que nous procédons à cette démonstration. Si vous êtes intéressé par les macros et bibliothèques que nous avons développées pour interpréter cette procédure à l’aide de ChemStation, veuillez m’envoyer un courriel à l’adresse indiquée sur votre écran, et davantage d’informations sur notre laboratoire sont disponibles à l’URL affichée sur votre écran.Merci beaucoup. Ici Jim Shoemaker.

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Métabolite profilage a été un atout précieux dans l'étude du métabolisme de la santé et de la maladie. Utilisant chromatographie liquide normale progressive couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution avec changement de polarité et un cycle de service rapide, nous décrivons un protocole pour analyser la composition métabolique polaire de matériel biologique avec une grande sensibilité, la précision et la résolution.

Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

La fiabilité des résultats dans les expériences de la métabolomique dépend de l'efficacité et la reproductibilité de la préparation de l'échantillon. Décrit une méthode rigoureuse et en profondeur qui permet l'extraction de métabolites à partir de fluides biologiques avec l'option de la suite à l'analyse des milliers de composés, ou seulement les classes de composés d'intérêt.

Multi-étape de préparation technique pour récupérer plusieurs classes de composés de métabolites pour approfondie et analyse métabolomique informatif

Les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite sont indispensables pour toutes les fonctions cellulaires. Ici, les auteurs décrivent un protocole qui permet une analyse parallèle de ces interactions avec une protéine de choix. Notre protocole a été optimisé pour les cultures de cellules végétales et combine purification d’affinité avec la protéine basé sur la spectrométrie de masse et de la détection de métabolite.

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Ce protocole décrit un débit unique pour les techniques analytiques et omiques complémentaires aboutissant à une caractérisation entièrement appariés de la matière organique naturelle et de la protéomique microbienne dans les écosystèmes différents. Cette approche permet des comparaisons robustes pour l’identification des voies métaboliques et les transformations importantes pour décrire la production de gaz à effet de serre et de prédire les réponses aux changements environnementaux.

Single-débit haute résolution analytique des Techniques complémentaires pour caractériser les mélanges complexes de matière organique naturelle

Le but de cet article est de décrire un protocole pour l’extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour l’analyse métabolomique, en particulier, l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse.

Extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse

Ici, nous présentons un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans le métabolisme central de carbone et d'énergie dans les réactions de synthèse de protéine sans cellules. Le mélange de synthèse sans cellules est dérivé avec de l'aniline pour une séparation efficace à l'aide d'une chromatographie liquide en phase inversée, puis quantifié par spectrométrie de masse à l'aide de normes internes étiquetées isotopiques.

Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

Une méthode pour l’analyse non ciblée des métabolites et des lipides de grain de blé est présentée. Le protocole comprend une méthode d’extraction de métabolites en acétonitrile et une méthodologie de spectrométrie de chromatographie-masse liquide inversée, avec acquisition dans des modes d’ionisation électrospray positive et négative.

Chromatographie liquide non ciblée-Analyse métabolomique basée sur la spectrométrie de masse du grain de blé

Nous présentons un protocole pour l’identification et la quantification des principales classes de métabolites solubles dans l’eau dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite est polyvalente, robuste et sensible. Il permet de séparer les isomères structurels et les formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau les uns des autres.

Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Les protocoles décrivent des méthodes de chromatographie liquide à haute performance couplées à la détection de l’indice de réfraction ou de la spectrométrie de masse pour l’étude des réactions métaboliques dans des systèmes complexes sans cellules à base de lysate.

Chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de réfraction ou de masse pour le profilage de métabolites dans des systèmes sans cellules à base de lysate

Nous avons construit un flux de travail métabolomique non ciblé qui intégrait XY-Meta et metaX ensemble. Dans ce protocole, nous avons montré comment utiliser XY-Meta pour générer une bibliothèque spectrale de leurre à partir de références de spectres en libre accès, puis effectué un contrôle FDR et utilisé le metaX pour quantifier les métabolites après avoir identifié les spectres métabolomiques.

Un flux de travail intégré d’identification et de quantification sur le métabolome non ciblé basé sur le contrôle FDR

Ce protocole vise à préserver les métabolites cellulaires pour la spectrométrie de masse sur cellule unique (SCMS) en combinant le lavage en solution de sel volatil, l’extinction rapide de l’azote liquide, la lyophilisation et le stockage à -8 °C. Il démontre que l’extinction de l’azote liquide est essentielle pour maintenir les profils de métabolites, tandis que le stockage prolongé au froid doit être minimisé pour prévenir les altérations métaboliques.

Préparation d’échantillons pour les études métabolomiques par spectrométrie de masse sur cellule unique : lavage, trempe, séchage et stockage combinés des cellules

Découvrez une procédure métabolomique en une étape pour quantifier glucides, acides organiques et aminés par GC/MS. Cette méthode améliore le dépistage néonatal en identifiant 38% de maladies génétiques supplémentaires non détectées par spectrométrie de masse en tandem.

Une étape métabolomique: glucides, acides organiques et aminés quantifiés dans une procédure unique

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