Dépistage de la toxicité chimique à base d’embryons : évaluation des effets sur le développement des embryons de poisson-zèbre

- Commencez par ajouter 5 embryons dans un milieu E3 dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, puis retirez l’excédent de milieu à l’aide d’une pipette. Ajoutez un milieu E3 contenant de la kanamycine dans chaque puits pour éviter la contamination. Laissez les embryons croître à 28 degrés Celsius.

Diluez le composé d’intérêt avec un solvant approprié, tel que le DMSO, pour préparer plusieurs concentrations ou doses, et testez l’effet de chaque dose sur les embryons en développement. Une fois que les embryons ont atteint le stade souhaité, pipeter chaque solution mère dans des puits individuels. Couvrez l’assiette avec un couvercle et faites-la tourner doucement pour mélanger le contenu. Laissez les embryons dans la plaque de puits croître à 28 degrés Celsius.

Au moment souhaité du développement embryonnaire, placez la plaque de puits sous un microscope approprié pour examiner le phénotype des embryons. Vous pouvez observer des phénotypes tels que la perte des yeux, le retard de croissance ou la perte de mélanocytes dans les embryons en développement. Dans le protocole suivant, nous testerons une bibliothèque de composés pour les inhibiteurs de petites molécules du développement du cerveau antérieur.

- Les banques de petites molécules sont généralement fournies dans une plaque source de 96 puits, chaque composé étant stocké dans du DMSO sous la forme d’un stock de 10 millimolaires. Environ 60 minutes avant que les embryons n’atteignent le stade souhaité, décongelez un nombre approprié de plaques de 96 puits contenant des aliquotes de petites molécules. Prenez note du numéro de série ou d’un autre numéro d’identification des plaques sources. Pour minimiser la condensation sur les plaques, décongeler dans une chambre de dessiccation contenant de la drierite.

Faites tourner brièvement les plaques dans une centrifugeuse de table équipée d’un adaptateur de plaque multi-puits. Retirez le ruban d’étanchéité en aluminium de la plaque source. À l’aide d’une pipette à 12 canaux, diluez les composés dans la plaque source à la concentration souhaitée avec du DMSO. Dans ce protocole, nous utilisons une concentration finale de 0,5 millimolaire et ajoutons 4,75 microlitres de DMSO pour diluer la plaque de stock de 10 millimolaires.

Lorsque les embryons de la plaque de 96 puits atteignent le stade souhaité, utilisez une pipette à 12 canaux pour transférer 2,5 microlitres de composés des plaques sources dans les plaques réceptrices contenant les embryons. Couvrez les plaques contenant maintenant les embryons et les composés avec des couvercles et inscrivez le numéro d’identification des plaques sources sur les plaques d’embryons. Mélangez les assiettes en les remuant doucement et placez-les dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius. Couvrez chaque plaque source contenant de petites molécules inutilisées avec du ruban d’étanchéité en aluminium et placez-la dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme.

Avant d’effectuer l’écran visuel, formulez un critère de réussite spécifique. Par exemple, dans un dépistage de petites molécules inhibitrices du développement du cerveau antérieur, un coup peut être un composé qui confère la perte du cerveau antérieur. L’absence d’yeux est un indicateur visuel facile de la perte du cerveau antérieur et ne nécessite aucune fluorescence pour être dosée.

Aux moments souhaités du développement, retirer de l’incubateur les plaques de 96 puits contenant les embryons traités au composé et examiner chaque puits au microscope stéréoscopique. Lors du dépistage de petites molécules inhibitrices du développement du cerveau antérieur, examinez les plaques à 28 heures pour détecter la perte de l’œil en tant que marqueur de l’inhibition du développement du cerveau antérieur. Consignez l’identité de la plaque et l’emplacement du puits dans lequel au moins 3 embryons sur 5 présentent le phénotype de frappe prescrit.

Remettez la plaque à 96 puits dans l’incubateur. Reconfirmez la perte des yeux et du cerveau antérieur à 48 heures. Même si les embryons n’ont pas de cerveau antérieur, ils survivront au moins quatre jours. Reconfirmez un coup potentiel en testant à nouveau les effets du composé à plusieurs doses. Pour chaque dose, 10 embryons sont testés dans 0,5 millilitre de milieu E3 dans un format de plaque de 48 puits.

Le moment de l’ajout du composé pour le nouvel essai doit être identique à celui du dépistage initial. Un résultat positif est confirmé lorsque le phénotype provoqué est reproduit de manière dose-dépendante lors d’un nouveau test du composé. Enfin, identifiez le composé à succès dans la base de données des petites molécules de la bibliothèque chimique.