0 vues • 3:39 min • April 30th, 2023
- Dissoudre le métronidazole dans de l’eau d’œuf contenant du DMSO, un solvant, et ajouter de la phénylthiourée, qui empêche la formation de pigments dans les embryons. Transférez quelques larves de l’âge approprié dans des plaques de traitement et de contrôle. Ensuite, ajoutez la concentration souhaitée de la solution de métronidazole sur la plaque d’essai et de l’eau d’œuf contenant du DMSO sur la plaque de contrôle.
Laissez les larves dans les deux plaques croître à 28 degrés Celsius. Les larves transgéniques produisent de la nitroréductase uniquement dans les hépatocytes, ce qui convertit le métronidazole en un médicament cytotoxique, entraînant la mort des hépatocytes ciblés. Après le traitement, retirez la solution de métronidazole de la plaque de traitement et lavez les embryons avec de l’eau d’œuf.
Ajoutez de la tricaïne pour anesthésier les larves et examinez-les au microscope à épifluorescence pour détecter une ablation sévère des hépatocytes - la destruction des cellules hépatiques. Vous observerez un foie beaucoup plus petit chez les individus traités que chez les individus du groupe témoin. Dans l’exemple de protocole, nous utiliserons le métronidazole pour l’ablation des hépatocytes chez les larves de poisson-zèbre transgénique afin d’étudier la régénération du foie.
- Transférez jusqu’à 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 25 millilitres d’eau d’œuf et placez la boîte à 28 degrés Celsius. Pour inhiber la pigmentation, ajoutez du PTU à la culture jusqu’à 10 heures après la fécondation. 80 heures après la fécondation, anesthésie les larves avec de la tricaïne et utilise un microscope à épifluorescence pour recueillir les larves positives au CFP, en ne gardant que les animaux ayant des foies de taille similaire
Remplacez ensuite l’eau de l’œuf de tricaïne par de l’eau d’œuf fraîche complétée par du PTU et remettez les larves de poisson-zèbre positives au CFP dans l’incubateur à 28 degrés Celsius. Pour traiter les larves de poisson-zèbre avec du MTZ, divisez d’abord le nombre approprié de larves dans deux récipients d’élevage différents. Conservez le groupe larvaire expérimental dans une solution de MTZ fraîchement préparée et le groupe témoin dans de l’eau d’œuf complétée par du DMSO.
Couvrez le groupe expérimental avec du papier d’aluminium pour éviter la photo-inactivation de la MTZ et incubez les deux groupes de larves de poisson-zèbre à 28 degrés Celsius. À la fin de la période d’ablation, retirez la solution MTZ des plaques et lavez la lave traitée MTZ deux à trois fois avec 25 millilitres d’eau d’œuf et en remuant, en jetant l’eau d’œuf après chaque lavage. Après le dernier lavage, immobiliser les larves avec la moitié de la concentration de tricaïne précédemment utilisée pour éviter l’œdème cardiaque et la mort chez les larves traitées au MTZ. Ensuite, utilisez le filtre CFP sur un microscope à épifluorescence pour évaluer les niveaux d’ablation des hépatocytes en fonction de la taille relative du foie de la lave traitée par MTZ. Considérez les poissons-zèbres avec de gros foies représentant 0 % à 5 % des larves à non ablation, ceux avec des foies de taille moyenne représentant 10 % à 20 % des larves à ablater partiellement, et ceux avec de très petits foies représentant 80 % à 90 % des larves à ablater complètement.