0 vues • 3:02 min • April 30th, 2023
- Une approche pour déterminer la fonction d’un gène consiste à inhiber son expression et à observer l’effet. Les oligomères morpholino sont souvent utilisés dans les études d’inactivation chez le poisson zèbre. Un morpholino est une molécule synthétique semblable à de l’ADN d’environ 25 bases de long, qui inhibe l’expression des gènes cibles.
Pour le traitement morpholino, placez un poisson anesthésié avec une nageoire caudale partiellement amputée sur une plaque d’injection et positionnez la plaque sous un stéréomicroscope. N’injectez que la face dorsale pendant que la face ventrale non injectée agit comme un contrôle. Les morpholinos peuvent fonctionner de deux manières en fonction de la séquence qu’ils ciblent. Tout d’abord, ils se combinent au site de début de traduction sur un ARNm et empêchent la synthèse des protéines en bloquant la traduction.
Deuxièmement, il peut se lier à la jonction intron-exon sur un pré-ARNm et empêcher un épissage correct, ce qui entraîne un transcrit défectueux qui sera dégradé par la cellule. Plus tard, examinez les nageoires caudales à la recherche d’excroissances. Les différences entre la repousse des régions traitées au morpholino et celles qui ne l’ont pas été indiquent que la protéine ciblée joue un rôle dans la régénération des nageoires. Dans ce protocole, nous utiliserons les morpholinos dans le cadre d’un test de régénération de la nageoire caudale.
- La veille de l’injection de morpholino, faites une plaque d’injection avec de l’agarose à 2 % qui a une encoche découpée à une extrémité du puits, ce qui aidera à stabiliser le poisson pour la procédure d’injection. Juste avant l’injection, diluez le morpholino marqué à la fluoroscéine dans de l’eau libre sans RNAase et DNAase à la concentration appropriée et incubez-le dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Chargez une aiguille d’injection préalablement préparée et coupez la pointe en biais.
Ensuite, anesthésez le poisson et placez-le sur la plaque d’injection. Retirez tout excès de liquide et placez la plaque sur la platine d’un stéréomicroscope. Orientez l’aiguille juste distale par rapport au rayon osseux.
Insérez doucement l’aiguille dans le tissu régénératif juste distal à chaque rayon osseux et poussez distalement jusqu’à ce qu’elle soit située dans le blastème. Lorsque l’aiguille est correctement localisée, suivez les instructions du système de micro-injection et injectez une goutte de cinq nanolitres de morpholino par injection. À chaque injection, une bouffée jaune de solution morpholino peut être observée, ce qui aide à localiser l’injection dans le blastème. En travaillant dorsalement à partir de la ligne médiane, injectez environ 75 nanolitres de morpholino par rayon osseux sur la face dorsale, en laissant la face ventrale comme contrôle par électroporation uniquement.