0 vues • 2:57 min • April 30th, 2023
- Commencez la procédure en plaçant un poisson adulte anesthésié sur une pile de papier absorbant. Utilisez maintenant une lame de rasoir stérile pour couper la nageoire caudale et transférez rapidement le poisson dans un réservoir contenant de l’eau douce pour la récupération. Transférez le clip de queue dans un tube propre contenant un tampon de lyse. Le tampon de lyse contient des détergents non ioniques, qui solubilisent la membrane plasmique et la membrane nucléaire d’une cellule. Le tampon contient également une enzyme appelée protéinase K qui décompose les protéines et permet la libération d’ADN dans le lysat. Il dégrade également les nucléases, protégeant l’ADN de la digestion des nucléases.
Maintenant, laissez les tubes avec les clips de queue dans un incubateur pendant la nuit pour décomposer complètement le tissu à 55 degrés Celsius avec une rotation continue. Ensuite, chauffez le tube à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes pour inactiver la protéinase K. Centrifugez le tube pour granuler le matériau non digéré et transférez le surnageant contenant de l’ADN dans un autre tube. Ajoutez de l’alcool pour précipiter l’ADN et centrifugez-le à nouveau pour recueillir l’ADN dans une pastille. Dans le protocole suivant, nous isolerons l’ADN de l’extrait de la queue d’un poisson-zèbre adulte et d’un embryon entier.
- Le jour de la préparation de l’ADN, ajoutez la protéinase K fraîche au tampon de lyse à une concentration de 1 milligramme par millilitre. Les tissus peuvent être prélevés sur un poisson adulte à l’aide d’une pince à nageoire ou sur un poisson embryonnaire.
Tout d’abord, anesthésie le poisson dans une solution de tricaïne. Attendez que les mouvements des branchies ralentissent. Ensuite, placez le poisson sur une pile de mouchoirs et, avec une lame de rasoir stérile, coupez un petit morceau de la nageoire caudale d’environ 2 à 3 millimètres de long. Placez rapidement le poisson dans un réservoir étiqueté avec de l’eau douce pour la récupération.
Prenez le clip d’aileron avec une pointe de pipette stérile et transférez-le dans un tube rempli de cent microlitres de tampon de lyse d’ADN. Assurez-vous d'étiqueter à la fois le réservoir de l'animal et le tube. Incuber tous les tissus collectés pendant au moins quatre heures et jusqu’à la nuit à 55 degrés Celsius.
Après l’incubation, inactivez la protéinase K en chauffant les tubes à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ces échantillons doivent être utilisés immédiatement pour la PCR, mais peuvent également être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à trois mois.