Encyclopedia of Experiments: Biology
Un abonnement à JoVE est nécessaire pour afficher ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- ابدأ بطبق بيتري يحتوي على أجنة في E3 medium. أضف tricaine لتخدير الأجنة وفينيلثيوريا ، محلول PTU ، لمنع تكوين الصباغ.
استخدام ماصة زجاجية لنقل أحد الأجنة dechorionated إلى طبق بيتري صغير مع قاع زجاجي ضحل في الوسط وإزالة الوسط الزائد.
صب الطبقة الأولى من الآغروز على الجنين، وملء تماما البئر الضحلة. ضع زجاج غطاء آخر على البئر وإضافة 1٪ agarose على رأس ذلك.
مرة واحدة في agarose الصلبة، وملء طبق بيتري مع المتوسط E3 التي تحتوي على tricaine. هذه هي الطبقة الثالثة ويحافظ على agarose والجنين رطب.
- قبل التركيب مباشرة، سخني محلول الآجروز إلى 65 درجة مئوية ثم اتركيه يبرد إلى حوالي 30 درجة مئوية حتى لا يتضرر الجنين من الحرارة وإضافة tricaine إلى محلول الآجروز. استخدام 35 ملليمتر أطباق أسفل الزجاج مع عدد صفر الزجاج المغطى القاع. وضع بلطف جنين dechorionated مع واحدة من جوانبه الجانبية نحو الجزء السفلي من الطبق مع ماصة زجاجية أو micropipette. ثم إزالة بعناية أي E3 المتبقية مع micropipette.
جمع ال أولا أغاروز حل ل ال صغير حسنا انشاء ب ال غطاء زجاج المرفقه ل ال قاع من ال صحن ل غطاء ال الجنين صنع واثق ذلك ال أغاروز يغطي ال صغير حسنا لكن هل لا طفح هو. غطاء ال صغير حسنا مع ال غطاء زجاج ل خلق أ ضيق agarose مليئة فضاء مع ال الجنين بين ال اثنان غطاء نظارة. مكان أ طبقة من 1% أغاروز حل على أعلى من ال غطاء زجاج كل اكثر ال قاع من ال صحن التي سوف حافظ ال غطاء زجاج في مكان مثل هو يتصلب. ثم ملء ال باق جزء من ال صحن مع E3 تتضمن 0.02% تريكين ل حافظ ال نظام رطب. ل تحديد ال الامثل أغاروز تركيز من أجل طبقة واحد اعتلى ال الاجنه في رفع تركيزات من أغاروز و أجرى الفاصل الزمني التصوير ل تحديد ال تركيز ذلك يقلل الجنين تشويه و الحركه ثم اختبر أ أدق نطاق من تركيزات استنادا الي على ال النتائج.
- الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي تحديد التركيز الأمثل للأغاروز للطبقة الأولى. اختبار تركيزات نانو مختلفة من الآغاروز مثل 0.030٪، 0.032٪، وهلم جرا، للعثور على التركيز الأمثل.
