L’axotomie laser à deux photons : une méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre et observer la récupération axonale
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 3:24 min • April 30th, 2023
- Placez les embryons d'intérêt dans la solution de Ringer pour inhiber la formation de pigments, qui commence 24 heures après la fécondation. Cela rend l’anatomie en développement plus visible, ce qui est nécessaire pour cette procédure. Transférez un embryon anesthésié à la tricaïne dans une chambre d’imagerie. Placez une lame de verre sur le dessus et observez-la sous votre microscope. Focus sur l’axone à blesser, qui est visible sous un laser de 488 nanomètres car il exprime transgéniquement la GFP.
Prenez une image avant du site. Ensuite, observez l’axone avec un laser de 910 nanomètres qui fait que la GFP devient fluorescente en rouge. Augmentez l’intensité de ce laser pour blesser la zone cible sans affecter les tissus environnants. Ce processus s’appelle l’axotomie. Prenez une nouvelle image avec le premier laser pour confirmer l’axotomie, qui apparaît sous forme de débris dispersés. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une axotomie des axones sensoriels périphériques dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un laser à deux photons.
- Si un microscope à deux photons personnalisé n’est pas disponible dans votre laboratoire, le microscope confocal à deux photons Zeiss 510 peut également être utilisé pour sectionner les axones. Nous commençons par placer l’embryon monté sur la scène et le mettre au point à l’aide d’un objectif d’eau 25x. Ensuite, allumez les deux lasers à photons et à argon dans un réglage multipiste afin qu’il soit possible de passer de l’un à l’autre.
Bien que les deux lasers soient utilisés pour détecter la GFP, l’émission à deux photons est visualisée en rouge et l’émission laser à l’argon en vert afin de différencier les deux. Utilisez le laser à argon pour identifier un axone à blesser. Sous les paramètres Z, marquez la première et la dernière section optique, prenez une image confocale et créez une projection maximale de la pile Z.
Éteignez le laser à argon et allumez le laser à deux photons. Scannez à une intensité d’environ 9 % de transmission pour vous assurer que l’axone est toujours net. Cliquez sur le bouton Arrêter pour que l’outil Recadrage soit disponible. Utilisez l’option Recadrer pour zoomer sur la zone d’intérêt. Habituellement, nous zoomons à environ 70x. Choisissez la région de l’axone à blesser et mettez l’accent sur cette région. Le zoom peut être vérifié sous l’onglet Mode.
Ensuite, sous l’onglet Canaux, modifiez l’intensité des deux photons d’environ 9 % de transmission à 15 % à 30 % de transmission. Pour activer les nouveaux paramètres, cliquez sur le bouton Fast XY, puis cliquez sur Arrêter rapidement après pour éviter des dommages excessifs. L’axone doit être considéré comme un débris dispersé si la procédure a fonctionné. Enfin, pour vous assurer que l’axone a bien été endommagé, revenez au laser à argon de 488 nanomètres. Prenez une autre image confocale et créez une projection maximale des piles Z.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant d'effectuer une axotomie sur des axones sensoriels périphériques chez des embryons de poisson zèbre à l'aide d'un laser à deux photons. La procédure améliore la visibilité de l'anatomie en développement en inhibant la formation de pigments.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Techniques d'imagerie
Contexte
- L'axotomie est une méthode utilisée pour étudier les lésions et la régénération axonales.
- Les embryons de poisson zèbre constituent un modèle précieux pour les études du développement.
- La microscopie à deux photons permet un ciblage précis des axones.
- L'expression de la GFP aide à visualiser les axones pendant l'imagerie.
Objectif de l'étude
- Démontrer la technique de section axonale chez les embryons de poisson zèbre.
- Fournir un protocole détaillé à destination des chercheurs du domaine.
- Mettre en évidence l'utilisation de la technologie laser à deux photons en recherche neuroscientifique.
Méthodes utilisées
- Les embryons sont traités avec de la phénylthiourée afin d'inhiber la formation de pigments.
- Des lasers à deux photons et à argon sont utilisés pour l'imagerie et la lésion des axones.
- Une imagerie confocale est réalisée pour confirmer les lésions axonales.
- Les réglages d'intensité des lasers sont ajustés pour minimiser les dommages aux tissus environnants.
Résultats principaux
- Une axotomie réussie est indiquée par l'apparition de débris dispersés.
- Les images confirment le site de la lésion avant et après le protocole.
- Le protocole est reproductible avec des montages microscopiques personnalisés et standard.
- La différenciation visuelle entre les émissions laser facilite un ciblage précis.
Conclusions
- La procédure d'axotomie est efficace pour l'étude des lésions axonales chez le poisson zèbre.
- La microscopie à deux photons est un outil précieux pour la recherche en neurosciences.
- Ce protocole peut être adapté à divers systèmes d'imagerie.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet une lésion axonale précise dans un modèle vertébré vivant, soutenant les études mécanistiques des voies de neurodégénérescence et de réparation. Elle offre une plateforme reproductible pour évaluer des composés neuroprotecteurs et les phénotypes de régénération en phase précoce de découverte. L'approche améliore la validation des cibles en reliant des perturbations génétiques ou pharmacologiques à des résultats fonctionnels au niveau axonal.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier l'intégrité axonale et les mécanismes de régénération dans un système vertébré pertinent pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Fournit un modèle de lésion quantifiable pour évaluer l'interaction avec la cible de candidats neuroprotecteurs ou pro-régénératifs.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Génère des lectures normalisées de lésions axonales adaptées à un criblage basé sur l'imagerie à haut contenu.
- Valeur opérationnelle : Favorise la reproductibilité des tests grâce à des paramètres laser contrôlés et à une visualisation des axones basée sur la GFP.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite la réduction des risques mécanistiques en reliant les cibles moléculaires aux phénotypes de réparation axonale.
- Valeur opérationnelle : Permet un suivi longitudinal de la récupération chez le même organisme, réduisant ainsi la variabilité dans l'évaluation préclinique de l'efficacité.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase de découverte précoce pour évaluer la modulation de la cible sur la résilience axonale, orientant ainsi les décisions d'identification de composés candidats avant tout investissement préclinique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur les gènes ou composés influant la dégénérescence et la régénération axonale.
- Criblage : Fournit des mesures quantitatives, basées sur l'imagerie, de l'intégrité axonale pour le profilage de bibliothèques de composés.
- Analyse : Permet la comparaison pré- et post-lésion de la structure axonale par microscopie confocale et intensité de fluorescence.
- Recherche translationnelle : S'appuie sur des modèles de maladies chez le poisson zèbre pour évaluer la conservation des mécanismes de réparation axonale.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable de lésion axonale applicable à plusieurs programmes de neurothérapeutique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance prédictive dans la validation des cibles en associant le mécanisme au phénotype axonal.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'induction des lésions axonales, renforçant la reproductibilité entre équipes et sites.
- Valeur stratégique : Réduit le risque biologique dans les programmes de neurodégénérescence grâce à une détection précoce du phénotype à risque.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions d'avancement ou d'abandon fondées sur des données de récupération axonale issues d'un modèle vertébré.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Des compétences en microscopie laser et en manipulation d'embryons de poisson zèbre sont requises.
- Une microscopie confocale à balayage laser à deux photons avec des lignées exprimant la GFP est essentielle.
- La standardisation de l'intensité laser et des paramètres d'exposition garantit une lésion uniforme entre les expériences.
- L'adaptation à différents types d'axones peut nécessiter une sélection de lignées transgéniques et un ajustement de la profondeur d'imagerie.
- L'inhibition du pigment par le PTU est nécessaire pour une visualisation optimale chez les embryons pigmentés.
F.A.Q. sur les biopharmaceutiques
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Dernière mise à jour : 29 août 2026