L’axotomie laser à deux photons : une méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre et observer la récupération axonale

- Placez les embryons d'intérêt dans la solution de Ringer pour inhiber la formation de pigments, qui commence 24 heures après la fécondation. Cela rend l’anatomie en développement plus visible, ce qui est nécessaire pour cette procédure. Transférez un embryon anesthésié à la tricaïne dans une chambre d’imagerie. Placez une lame de verre sur le dessus et observez-la sous votre microscope. Focus sur l’axone à blesser, qui est visible sous un laser de 488 nanomètres car il exprime transgéniquement la GFP.

Prenez une image avant du site. Ensuite, observez l’axone avec un laser de 910 nanomètres qui fait que la GFP devient fluorescente en rouge. Augmentez l’intensité de ce laser pour blesser la zone cible sans affecter les tissus environnants. Ce processus s’appelle l’axotomie. Prenez une nouvelle image avec le premier laser pour confirmer l’axotomie, qui apparaît sous forme de débris dispersés. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une axotomie des axones sensoriels périphériques dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un laser à deux photons.

- Si un microscope à deux photons personnalisé n’est pas disponible dans votre laboratoire, le microscope confocal à deux photons Zeiss 510 peut également être utilisé pour sectionner les axones. Nous commençons par placer l’embryon monté sur la scène et le mettre au point à l’aide d’un objectif d’eau 25x. Ensuite, allumez les deux lasers à photons et à argon dans un réglage multipiste afin qu’il soit possible de passer de l’un à l’autre.

Bien que les deux lasers soient utilisés pour détecter la GFP, l’émission à deux photons est visualisée en rouge et l’émission laser à l’argon en vert afin de différencier les deux. Utilisez le laser à argon pour identifier un axone à blesser. Sous les paramètres Z, marquez la première et la dernière section optique, prenez une image confocale et créez une projection maximale de la pile Z.

Éteignez le laser à argon et allumez le laser à deux photons. Scannez à une intensité d’environ 9 % de transmission pour vous assurer que l’axone est toujours net. Cliquez sur le bouton Arrêter pour que l’outil Recadrage soit disponible. Utilisez l’option Recadrer pour zoomer sur la zone d’intérêt. Habituellement, nous zoomons à environ 70x. Choisissez la région de l’axone à blesser et mettez l’accent sur cette région. Le zoom peut être vérifié sous l’onglet Mode.

Ensuite, sous l’onglet Canaux, modifiez l’intensité des deux photons d’environ 9 % de transmission à 15 % à 30 % de transmission. Pour activer les nouveaux paramètres, cliquez sur le bouton Fast XY, puis cliquez sur Arrêter rapidement après pour éviter des dommages excessifs. L’axone doit être considéré comme un débris dispersé si la procédure a fonctionné. Enfin, pour vous assurer que l’axone a bien été endommagé, revenez au laser à argon de 488 nanomètres. Prenez une autre image confocale et créez une projection maximale des piles Z.