Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

L'objectif général de cette procédure est de préparer le tissu cérébral de souris pour la microscopie électronique immunocytochimique. Cela est réalisé en fixant d'abord le cerveau par perfusion de l'animal. La deuxième étape de la procédure consiste à découper le cerveau et à traiter les sections pour l'immunohistochimie.

La troisième étape de la procédure consiste à décalcifier, déshydrater et inclure les sections. La dernière étape de la procédure est de couper des sections ultraminces. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant, avec une haute résolution spatiale, la distribution de diverses protéines au sein de différentes régions et types cellulaires du système nerveux central.

Bonjour, je suis Maria Trombley du laboratoire d'Esca, du département de neurobiologie et d'anatomie de l'Université de Rochester. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de préparation du tissu cérébral de souris pour la microscopie électronique immunocytochimique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les interactions entre les microglies et les synapses au cours du développement, de la plasticité dépendante de l'expérience et du vieillissement.

Commençons. Après avoir fixé le cerveau de la souris par perfusion intracardiaque post mortem, post-fixez-le dans environ 10 millilitres de formaldéhyde à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Lavez le cerveau à quatre degrés Celsius, dans du 1 XPBS, trois fois pendant 10 minutes à chaque lavage, en utilisant un vortex et du 1 XPBS glacé, puis découpez immédiatement le cerveau en sections transversales de 50 micromètres.

Utilisez un pinceau fin pour transférer les sections sélectionnées dans un flacon en verre rempli de PBS à quatre degrés Celsius. Conservez les sections restantes dans un cryoprotecteur à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs années sans altération. Traitez au maximum 10 sections libres pour la coloration dans chaque flacon en verre.

Utilisez une pipette de transfert pour remplacer le PBS X par du borohydrure de sodium à 0,1 % frais dans du PBS. Changez rapidement les solutions afin d'éviter que les sections ne s'assèchent. Incubez pendant 30 minutes, rincez les sections avec du PBS X trois fois pendant 10 minutes chacune. Veillez à éliminer toutes les bulles et bloquez avec du PBS X contenant 0,5 % de gélatine et 5 % de sérum normal, adapté à l'anticorps secondaire qui sera utilisé.

Incuber pendant deux heures. Ajouter l'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage. Incuber pendant 48 heures.

Rincer avec un XPB S3 fois pendant 10 minutes. Incuber chaque fois avec un anticorps secondaire marqué à la biotine dilué dans la solution de blocage pendant deux heures. Rincer trois fois 10 minutes dans un XPBS comme précédemment.

Incuber avec de la streptavidine peroxydase diluée dans la solution de blocage pendant une heure. Rincer les sections une fois dans du PBST 1X et deux fois dans du TBST 1X pendant 10 minutes chacun. Pour révéler le marquage, incuber les sections avec une solution fraîchement préparée contenant 0,05 % de DAB et 0,01 % de peroxyde d'hydrogène dans du TBST 1X.

Lorsque la coloration est visiblement brun foncé ou que la réaction a duré cinq minutes, rincez les sections avec un XTBS pour arrêter la réaction. Rincez ensuite une fois avec un XTBS et deux fois avec un x PB pendant 10 minutes chacun. Dans une hotte, utilisez un pinceau fin pour transférer les sections dans une plaque de culture multipuits remplie d’un XPB.

Retirer le PB d'un puits à l'aide d'un pinceau fin pour étaler immédiatement les sections à plat. Ajouter une solution d'osmium tétraoxyde à 1 % dans un PB avant de passer au puits suivant, puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Transférer les sections d'OSM dans des vials en verre.

Rincer avec un XPB trois fois pendant 10 minutes. Déshydrater les sections dans des concentrations croissantes d'éthanol. Ensuite, utiliser l'oxyde de propylène comme décrit dans la partie textuelle de ce protocole.

Utilisez un pinceau fin rincé dans de l'oxyde de propylène pour transférer les sections dans une résine dupant fraîchement préparée. Pour l'impregnation pendant la nuit, placez la boîte contenant les sections dans une étuve à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour ramollir la résine, utilisez un pinceau rincé avec de l'oxyde de propylène afin d'enduire une pellicule d'inclusion en chlor d'une fine couche de résine.

Transférez la section sur le film et recouvrez-la uniformément d'un autre film d'inclusion. Répartissez des poids légers d'environ deux grammes sur le dessus pour aider la résine à s'étaler. Laissez la résine polymériser à 55 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures dans un incubateur. Après polymérisation, retirez les poids dans la couche supérieure du film d'inclusion sous un microscope binoculaire.

Sélectionnez des zones d’intérêt de deux millimètres sur deux millimètres et utilisez une lame de rasoir pour les exciser du film. Collez les zones d’intérêt sur les extrémités de blocs de résine à l’aide de Super Glue. Incubez une heure dans un four à 55 degrés Celsius.

Utilisez une lame de rasoir pour tailler le bloc de résine en forme de trapèze isocèle, la forme optimale pour l'aspiration ultrafine. À l'aide d'un microtome et d'un couteau en verre, retirez la colle à la surface du tissu afin d'obtenir une surface plane. Pour l'aspiration.

Remplissez la cuve du couteau en verre avec de l’eau doublement distillée et coupez quelques sections comprises entre 0,5 et un micron. Utilisez une boucle parfaite pour transférer les sections sur une lame Super Frost. Séchez pendant une minute sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius et coloriez avec du bleu de toluidine 0,1 % pendant une minute.

Utilisez une bouteille pulvérisatrice pour rincer l'excès de colorant à l'eau doublement distillée. Au microscope optique, examinez les sections afin de distinguer le tissu coloré de la résine. Coupez des sections semi-minces jusqu'à ce que la limite entre le tissu et la résine atteigne approximativement le milieu de la section. Remplacez le couteau en verre par un couteau en diamant et remplissez le bac avec de l'eau doublement distillée.

Couper l'argent en tranches ultrafines allant de l'argent à l'or. Réaliser des sections de 60 à 80 nanomètres d'épaisseur. Utiliser des pinces fines inversées pour prélever soigneusement les sections sur des grilles en cuivre à mailles.

Séchez les grilles sur du papier filtre pour améliorer le contraste. Utilisez des pinces fines inversées pour transférer une grille dans une goutte de citrate de plomb pendant deux minutes. Rincez délicatement la grille en l'immergeant dans trois bains successifs d'eau doublement distillée.

Séchez la grille sur du papier filtre et rangez-la dans une boîte à grilles pour un examen ultérieur au microscope électronique. Examinez les grilles au microscope électronique afin de visualiser la coloration immunohistochimique, mais aussi la morphologie des éléments cellulaires, leurs organites intracellulaires et leurs relations mutuelles.

Ici, une immunomarquage représentatif pour IBA one est montré au niveau microscopique optique. La distribution cellulaire de IBA one est limitée aux microglies, ce qui confirme sa spécificité au niveau microscopique électronique. Les microglies marquées immunologiquement pour IBA one, ainsi que leurs périkaryons et leurs prolongements, sont visibles.

La coloration immunoperoxydase au DAB apparaît sous forme d'un précipité électrodense. D'autres exemples d'IBA un, de prolongements microgliaux immunomarqués, présentent des tailles et des formes variées. Un grossissement plus élevé révèle divers organites intracellulaires à l'intérieur d'un des prolongements microgliaux, ainsi que les relations ultrastructurales entre un autre prolongement microglial et des éléments voisins du neuropil, notamment des synapses.

Nous venons de vous montrer comment préparer le tissu cérébral de souris pour la microscopie électronique immunocytochimique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre rigoureusement toutes les étapes et de manipuler délicatement le tissu cérébral. Voilà donc tout ce qu'il faut savoir.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.