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Recherche sur le cancer
0 vues • 3:19 min • April 30th, 2023
Le lentivirus est un rétrovirus qui contient du matériel génétique à ARN. Ce virus fournit une méthode efficace et stable pour introduire des transgènes dans les lignées cellulaires cancéreuses. Commencez par ajouter de la neuraminidase à un tube contenant du lentivirus qui exprime la protéine fluorescente verte, ou GFP. Maintenez le tube à 37 degrés Celsius pendant une heure pour augmenter l'efficacité de liaison du virus.
Ensuite, centrifugez un tube contenant une suspension de cellules tumorales pour former une pastille. Ajoutez un milieu mammosphérique contenant du polybrène pour remettre les cellules en suspension. Le polybrène est un polymère cationique qui augmente l’efficacité de l’infection lentivirale. Maintenant, plaquez le nombre optimal de cellules tumorales par puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits. Ajouter la quantité requise de lentivirus dans chaque puits de la plaque de culture.
Faites tourner la plaque pour mélanger le contenu et conservez-la à 37 degrés Celsius pendant 96 heures avec un apport continu de dioxyde de carbone. Le lentivirus pénètre dans la cellule et libère de l’ARN. La transcriptase inverse virale convertit l’ARN en ADN double brin qui s’intègre dans le génome de l’hôte. Placez la plaque sous un microscope fluorescent et surveillez les cellules pour une transduction réussie. Les cellules transduites deviennent fluorescentes en raison de l’expression de la GFP.
Dans l’exemple de protocole, nous effectuerons la transduction de cellules tumorales dissociées de PDX avec des vecteurs lentiviraux.
Pour transduire les cellules tumorales, centrifugez les cellules isolées pour les remettre en suspension dans deux millilitres de milieu de mammographie. Après le comptage, centrifugez à nouveau les cellules et mettez à nouveau la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu de mammographie, complétés par 20 microlitres de polybrène. Ensuite, plaquez 2 fois 10 à la cinquième cellules tumorales viables par puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits à très faible adhérence et des particules lentivirales aux cellules à une multiplicité d’infection de 10.
Faites tourner la plaque pour mélanger le virus avec les cellules et incubez les co-cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à 96 heures, en ajoutant 500 microlitres de milieu de mammosphère frais après les premières 24 heures. Lorsqu’au moins 10 % des cellules sont positives à la GFP, transférez les cellules transduites d’au moins un puits dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace et lavez le puits avec un millilitre de milieu de mammographie.
Mettez le lavage en commun avec les cellules et centrifugez les cellules tumorales dans 10 millilitres de HBSS plus HEPES. Enfin, remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres d’extrait de matrice basale sur de la glace et chargez les cellules intégrées dans une seringue à insuline de 0,5 millilitre pour la réimplantation.