Dissociation mécanique : une méthode pour obtenir des cellules viables à partir d’un tissu

Tout d’abord, pesez un fragment de tissu et mesurez sa longueur, sa largeur et sa hauteur. Placez le tissu dans une boîte de culture avec un milieu de culture et coupez-le en petits morceaux à l’aide d’un scalpel. Transférez le tout dans un tube C pour l’homogénéisation à l’aide d’une pipette Pasteur.

Placez le tube dans un dissociateur mécanique et exécutez les cycles nécessaires. L’appareil utilise des forces mécaniques pour extraire des cellules uniques viables de l’échantillon de tissu tout en maintenant l’intégrité cellulaire, y compris les protéines de surface. Décantez l’homogénat à l’aide d’une crépine cellulaire fixée sur un tube de centrifugation.

Réhomogénéisez le tissu restant et filtrez l’homogénat à travers la crépine cellulaire dans le tube. Centrifuger l’homogénat et retirer le surnageant. Maintenant, remettez la pastille cellulaire en suspension dans le milieu de culture et transférez une petite quantité de suspension cellulaire dans un tube contenant une coloration bleue de trypan.

Après la coloration, transférez les cellules sur une lame d’hémocytomètre. Comptez les cellules viables transparentes. Les cellules mortes absorbent la coloration, car leur membrane cellulaire n’est pas intacte. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une dissociation non enzymatique de tissus humains frais pour une analyse quantitative et qualitative des cellules CD45+.

- Commencez par peser l’échantillon de tissu, puis mesurez la longueur, la largeur et la hauteur du tissu. Transférez ensuite le fragment de tissu dans une petite boîte de Pétri contenant 1 millilitre de milieu cellulaire hématopoïétique chimiquement défini et sans sérum approprié et utilisez un scalpel stérile pour couper les échantillons en petits morceaux de 1 à 2 millimètres carrés. Ensuite, transférez le contenu du plat dans un tube en C dissociateur mécanique et rincez le plat et le scalpel avec 2 millilitres de fluide.

Ajoutez le lavage dans le tube C, puis exécutez le programme de dissociation mécanique 8.01 deux fois de suite pour homogénéiser doucement les fragments de tissu en une suspension unicellulaire. Après le deuxième cycle, décantez l’homogénat à travers une crépine à cellules de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, utilisez la même pipette Pasteur que celle du lavage de la boîte de Pétri pour transférer tout liquide restant dans le tube C dans la crépine de la cellule.

Ensuite, à l’aide d’une micropipette de 1 millilitre, transférez le liquide filtré dans un tube conique de 15 millilitres et rincez le tube C avec 3 millilitres supplémentaires de fluide. Transférez ce lavage à travers la crépine de la cellule dans le tube de 50 millilitres. Ensuite, déplacez doucement le tissu non homogénéisé autour de la passoire avec un embout propre de 1 millilitre pour presser la quantité maximale de liquide résiduel emprisonné dans le tissu dans le tube de 50 millilitres. Placez maintenant la passoire cellulaire à l’envers sur le tube C d’origine et rincez la passoire avec 3 millilitres de fluide supplémentaires afin que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C.

Réhomogénéisez le tissu pendant deux cycles supplémentaires, comme nous venons de le démontrer, puis versez à nouveau le deuxième homogénat à travers la crépine cellulaire. Rincez le tube C avec encore 3 millilitres de fluide. Filtrez ensuite le surnageant à travers la passoire et pressez le liquide résiduel hors du tissu, comme nous venons de le démontrer. À ce stade, un volume d’environ 2,5 millilitres de suspension à cellule unique doit être présent dans le tube de 15 millilitres, et environ 9 millilitres doivent être observés dans le tube de 50 millilitres.

Pour séparer le surnageant tissulaire des cellules, centrifugez d’abord les deux tubes d’homogénat pendant 15 minutes à 600 G à température ambiante. Décantez le surnageant du tube de 15 millilitres dans un tube de 1,5 millilitre, en le plaçant à 4 degrés Celsius, et jetez le surnageant du tube de 50 millilitres. Ensuite, tapotez doucement chaque tube sur une surface dure pour briser chacune des pastilles de cellule.

Remettez en suspension la pastille de cellules libres dans le tube de 50 millilitres avec 500 microlitres de fluide et transférez les cellules dans le tube de 15 millilitres pour remettre en suspension la deuxième pastille. Rincez ensuite le tube de 50 millilitres avec 500 microlitres supplémentaires de fluide et transférez le lavage dans le tube de 15 millilitres pour une récupération cellulaire maximale. Après avoir compté le nombre de cellules viables par exclusion du bleu de trypan, granulez la suspension cellulaire.

Enfin, faites tourner le surnageant tissulaire réservé. Ensuite, transférez soigneusement le surnageant dans au moins un tube propre sans toucher ni déranger la pastille et stockez-la à moins 80 degrés Celsius pour une analyse future en aval.