Essai de formation de colonies de gélose molle : une méthode pour tester les effets de nouveaux composés sur la prolifération des cellules cancéreuses

Pour commencer, prenez une concentration appropriée d’agarose fondue dans un tube conique et ajoutez-y la quantité désirée de milieu de culture chaud. Retournez doucement pour mélanger le contenu. Ajoutez ce mélange dans chaque puits d’une assiette à six puits et laissez-le se solidifier. C’est la couche inférieure. Ensuite, traitez les cellules cancéreuses avec le composé d’intérêt et ajoutez la concentration requise d’agarose.

Maintenant, versez ce mélange contenant le nombre souhaité de cellules par millilitre dans chaque puits. Il s’agit d’une couche contenant des cellules. Une fois que le milieu se solidifie, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une semaine. Préparez une couche nourricière en mélangeant de l’agarose au milieu et complétez ce mélange avec le composé d’intérêt. Ajoutez délicatement cette couche d’alimentation dans chaque puits, laissez-la se solidifier et incubez la plaque à 37 degrés Celsius.

Répétez cette procédure d’alimentation chaque semaine pour reconstituer les cellules avec le milieu jusqu’à ce que des colonies se forment. Si le composé d’intérêt est un inhibiteur de la tumorigénicité, il supprimera la croissance des cellules, ce qui entraînera peu de colonies dans les puits. Dans le protocole suivant, nous effectuerons un test de formation de colonie de gélose molle pour étudier l’effet des inhibiteurs de PADI sur la tumorigénicité des cellules cancéreuses du sein.

Commencez cette procédure en préparant de l’agarose 2-hydroxyéthyle à 3 %. Dans une bouteille en verre propre et sèche de 100 millilitres, ajoutez 0,9 gramme d’agarose 2-hydroxyéthyle suivi de 30 millilitres d’eau distillée. Passez le mélange au micro-ondes pendant 15 secondes et remuez doucement. Répétez cette étape jusqu’à ce que la poudre d’agarose se dissolve complètement. Ensuite, autoclavez la solution contenant le flacon pendant 15 minutes.

Laissez la solution d’agarose refroidir à température ambiante avant de l’utiliser ultérieurement. Préchauffez plusieurs pipettes de cinq millilitres et de 10 millilitres dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour éviter que l’agarose ne se solidifie dans la pipette lors de la manipulation. Desserrez partiellement le couvercle de la bouteille et passez au micro-ondes la solution préfabriquée de 2-hydroxyéthyl agarose à 3 % pendant 15 secondes. Ensuite, agitez doucement la solution et passez au micro-ondes pendant 15 secondes supplémentaires.

Soyez prudent lorsque vous faites tourner la solution d’agarose car la solution remonte lorsqu’elle est exposée à l’air et peut déborder. S’il y a des résidus de gel solide dans la bouteille, passez au micro-ondes pendant quelques secondes de plus. Conservez le flacon contenant la solution d’agarose dans un bain-marie à 45 degrés Celsius pendant les étapes suivantes pour éviter que la solution d’agarose ne se solidifie prématurément.

Ensuite, transférez 12 millilitres de milieu chauffé à l’aide des pipettes préchauffées dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Ajoutez immédiatement trois millilitres de la solution d’agarose à 3 % et retournez doucement le tube conique pour mélanger l’agarose avec le milieu. Ajoutez ensuite délicatement deux millilitres de ce mélange dans chaque puits d’une plaque de culture à six puits sans former de bulles d’air. Incuber la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant une heure pour permettre au mélange de se solidifier.

Une fois que le mélange s’est solidifié, placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. La couche inférieure est maintenant prête à l’emploi.

Un aspect difficile de cette procédure est de s’assurer que toutes les cellules sont réparties uniformément et que le gel d’agarose fondu ne se solidifie pas avant l’ajout à chaque puits, afin de s’assurer que les cellules sont mélangées dans le milieu avant d’ajouter le gel d’agarose liquide. De plus, les pipettes sont préchauffées au préalable pour éviter que les solutions ne se solidifient lors de la manipulation.

Pour préparer la couche contenant la cellule, essayez d’abord MCF10DCIS cellules et diluez-les à une concentration cellulaire de 40 000 cellules par millilitre. Prenez ensuite huit millilitres de milieu à l’aide de pipettes préchauffées et transférez-les dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Ajoutez immédiatement deux millilitres d’agarose à 3 % dans le tube conique et retournez doucement pour mélanger l’agarose avec le support. Évitez de former des bulles.

Ensuite, prenez deux millilitres de cellules et traitez-les avec deux BB-chlor-amidine micromolaires dans du DMSO, ou du DMSO seul comme contrôle. Après le traitement, mélanger les cellules avec une agarose à 0,6 % dans une dilution un à un pour obtenir une concentration finale d’une BB-chlor-amidine micromolaire. Ensuite, prenez un millilitre du mélange cellule-agarose et ajoutez-le délicatement sur la couche inférieure de la plaque de culture à six puits.

Placez la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes pour permettre à la couche supérieure de se solidifier. Une fois que le mélange s’est solidifié, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une semaine avant d’ajouter la couche d’alimentation. Commencez la préparation de la couche d’alimentation en passant au micro-ondes la solution préfabriquée de 2-hydroxyéthyle agarose à 3 % comme précédemment, et en équilibrant le flacon de solution d’agarose dans un bain-marie à 45 degrés Celsius.

Mélangez un millilitre de solution d’agarose à 3 % avec neuf millilitres de milieu chaud dans un tube conique de 50 millilitres et retournez doucement pour mélanger l’agarose avec le milieu. Évitez de former des bulles d’air. Après avoir traité le mélange avec du BB-chlor-amidine, ajoutez doucement un millilitre du mélange dans chaque puits de la plaque de culture à six puits contenant le fond et les couches molles. Placez ensuite la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes pour permettre au mélange de se solidifier.

Une fois que la couche d’alimentation s’est solidifiée, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Répétez cette procédure d’alimentation chaque semaine en superposant un millilitre de solution de traitement du milieu d’agarose à 0,3 % sur la couche nourricière existante pour reconstituer les cellules avec de nouveaux milieux jusqu’à ce que la formation de colonies soit observée.