Décellularisation des coussinets adipeux mammaires : dérivation d’hydrogels de matrice extracellulaire à partir de coussinets adipeux mammaires

Tout d’abord, placez des coussinets adipeux mammaires ou MFP dans une boîte avec une solution de trypsine-EDTA et incubez pendant la durée souhaitée pour briser les adhérences de la matrice cellulaire. Lavez les MFP avec de l’eau déminéralisée et passez-les à travers une passoire. Placez les mouchoirs dans un bécher à l’aide d’un agitateur et ajoutez le Triton X-100. Remuer pour lyser les cellules sans affecter les facteurs de croissance dans la matrice extracellulaire du tissu.

Filtrez les MFP et rincez-les à l’eau déminéralisée. Transférez les tissus dans le bécher et ajoutez de l’acide désoxycholique pour lyser les cellules restantes. Ensuite, filtrez les MFP et placez-les dans un bécher contenant de l’eau déminéralisée avec de la pénicilline-streptomycine pour éviter la contamination. Incuber le bécher à 4 degrés Celsius pendant la nuit.

Filtrez les MFP et placez-les dans un bécher contenant de l’éthanol et de l’acide peracétique. L'acide peracétique augmente la rigidité de la matrice extracellulaire du tissu. Remuez pendant un certain temps et répétez l’étape de filtrage. Lavez les MFP avec du PBS, puis avec de l’eau déminéralisée. Transférez les MFP filtrés dans un bécher contenant du propane-1-ol.

Remuez pendant un certain temps, filtrez le contenu et lavez les MFP avec de l’eau déminéralisée. Séchez les MFP et rangez-les à moins 80 degrés Celsius. Dans le protocole suivant, nous effectuerons la décellularisation des coussinets adipeux mammaires murins.

Tout d’abord, placez les MFP dans des boîtes de six centimètres avec cinq millilitres de solution de trypsine-EDTA. Vaporisez et essuyez la vaisselle avec de l’éthanol à 70 % et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Utilisez des passoires de 0,7 millimètre pour laver les MFP avec de l’eau déminéralisée en versant de l’eau sur le tissu trois fois. À l’aide d’une pince, massez manuellement le tissu entre les lavages.

Ensuite, séchez brièvement le mouchoir sur une lingette délicate et pesez-le. Placez les tissus séchés dans un bécher pré-autoclavé contenant une barre d’agitation de taille appropriée et recouvrez les tissus de 60 millilitres de polyéthoxyéthanol t-octylphénoxy à 3 % par gramme de tissu. Remuer pendant une heure à température ambiante. Ensuite, versez le contenu des béchers dans une passoire.

Rincez le bécher avec de l’eau déminéralisée et versez-le sur les mouchoirs. Répétez ce processus de rinçage deux fois de plus, en vous assurant d’utiliser des pinces pour masser manuellement le tissu entre les rinçages. Après cela, séchez brièvement le mouchoir sur une lingette délicate et pesez. Remettez les mouchoirs et les barres d’agitation dans les mêmes béchers et recouvrez-les de 60 millilitres d’acide désoxycholique à 4 % par gramme de tissu. Remuer à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, versez le contenu du bécher dans une passoire à mailles. Rincez le bécher avec de l’eau déminéralisée et versez-le sur les mouchoirs. Répétez ce processus de rinçage deux fois de plus, en vous assurant d’utiliser des pinces pour masser manuellement le tissu entre les rinçages. Séchez brièvement le chiffon rincé sur une lingette délicate et pesez-le.

Placez les tissus séchés dans le même bécher avec de l’eau fraîche déminéralisée complétée par de la pénicilline streptomycine à 1 %. Couvrez hermétiquement le bécher d’un film de paraffine et laissez-le à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, égouttez le contenu du bécher dans une passoire. Séchez brièvement le mouchoir sur une lingette délicate et pesez-le. Ensuite, placez les MFP dans le même bécher avec une barre d’agitation de taille appropriée.

Couvrez le tissu avec 60 millilitres d’une solution contenant 4 % d’éthanol et 0,1 % d’acide peracétique par gramme de tissu. Remuer à température ambiante pendant deux heures. Versez le contenu du bécher dans une passoire de 0,7 millimètre. À l’aide d’une pince, massez manuellement le tissu et remettez le contenu dans le bécher. Lavez le mouchoir en le recouvrant de 60 millilitres de 1X PBS par gramme de mouchoir.

Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez l’ensemble du processus de lavage une fois de plus. Ensuite, versez le contenu du bécher dans une passoire de 0,7 millimètre. À l’aide d’une pince, massez manuellement le mouchoir et remettez le contenu dans le bécher. Lavez le mouchoir en le recouvrant de 60 millilitres d’eau déminéralisée par gramme de mouchoir.

Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez l’ensemble du processus de lavage une fois de plus. Séchez brièvement le mouchoir lavé sur une lingette délicate et pesez-le. Versez le tissu et le contenu dans une passoire et utilisez une pince pour masser manuellement le tissu. Remettez le contenu dans le bécher et recouvrez les mouchoirs avec 60 millilitres de n-propanol à 100 % par gramme de tissu.

Remuer à température ambiante pendant une heure. Ensuite, séchez brièvement le mouchoir sur une lingette délicate et pesez-le. Versez le tissu et son contenu dans une passoire de 0,7 millimètre et utilisez une pince pour masser manuellement le tissu. Remettez le contenu dans le bécher et lavez le mouchoir en le recouvrant de 60 millilitres d’eau déminéralisée par gramme de mouchoir.

Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez ce processus de lavage trois fois. Après cela, séchez brièvement le mouchoir sur une lingette délicate et pesez-le. Transférez le mouchoir dans un tube de 15 millilitres étiqueté et congelez-le à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.