Gonflage de l’agarose pulmonaire entière : une méthode de préparation des poumons pour l’imagerie en direct ex vivo

- Tout d’abord, placez une souris euthanasiée sur une planche de dissection. Juste au-dessus de l’abdomen, coupez la peau et le péritoine. Percez le diaphragme et coupez le long des côtes et de la cage thoracique jusqu’à la trachée. Créez une petite incision dans la trachée. Insérez doucement une aiguille à l’intérieur de la trachée sans blesser la carène et fixez-la avec une pince. Injectez de l’agarose à bas point de fusion à température corporelle normale à l’intérieur des poumons. Retirez lentement la seringue et gardez l’aiguille à l’intérieur pour éviter le reflux de l’agarose.

Versez du PBS froid sur les poumons pour favoriser la gélification de l’agarose. Retirez l’aiguille et fixez la trachée à l’aide d’une pince pour éviter le reflux d’agarose non solidifié. Ouvrez le sternum, tenez la trachée avec une pince et coupez-la à l’aide de ciseaux. Retirez les poumons de la cavité thoracique. Séparez les lobes dans le support. Placer à l’intérieur des puits d’imagerie dans des conditions physiologiques pour la microscopie. L’agarose préserve la morphologie pulmonaire à des températures physiologiques qui aident à observer les interactions cellulaires en direct. Dans le protocole suivant, nous démontrerons l’imagerie en direct ex vivo des poumons pour étudier les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales.

- Pour préparer les poumons à l’imagerie en direct ex vivo, commencez par immobiliser la souris sur un couvercle en mousse de polystyrène recouvert d’un morceau de trempage et stérilisez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision épigastrique transversale à travers la peau, suivie d’une incision similaire à travers le péritoine. Ensuite, en déplaçant la planche de dissection en position verticale, coupez l’aorte descendante de sorte que le sang s’accumule dans l’abdomen et non dans la cavité thoracique.

Coupez une petite ouverture dans le diaphragme pour libérer le vide, puis coupez le long de la cage thoracique pour exciser le diaphragme et visualiser les poumons. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez la peau jusqu’à la trachée au-dessus de la cage thoracique, en laissant les côtes intactes. Ensuite, séparez la peau de la cage thoracique et retirez le tissu conjonctif environnant pour exposer la trachée, en prenant soin de ne pas endommager la trachée elle-même. Coupez une petite ouverture d’environ 1 millimètre de diamètre dans la trachée exposée, parallèlement aux anneaux cartilagineux, aussi près que possible du larynx, sans couper complètement la trachée.

Ensuite, insérez doucement une aiguille de calibre 20 de 4 à 5 millimètres dans la trachée sans aucune contre-force. L’extrémité de l’aiguille doit être visible à travers la trachée. Remplissez une seringue de 400 microlitres d’agarose à 37 degrés Celsius à 2 % à basse température de fusion, puis stabilisez l’aiguille avec une pince. En gardant la planche de dissection verticale, instillez lentement toute la quantité d’agarose chaude à travers l’aiguille dans les poumons. Une fois les poumons gonflés, détachez la seringue tout en gardant l’aiguille à l’intérieur de la trachée et versez environ 50 millilitres de PBS à 20 degrés Celsius sur les poumons pour aider à fixer l’agarose.

Lorsque l’agarose s’est solidifiée, retirez l’aiguille et utilisez une pince pour fermer la trachée afin d’éviter la fuite de toute agarose non solidifiée. Maintenant, ouvrez davantage la poitrine par sternotomie et saisissez la trachée avec des pinces. Ensuite, à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux, coupez complètement la trachée. Pour retirer les poumons, tirez doucement la trachée vers le haut, coupez le tissu conjonctif et l’œsophage, et retirez complètement les poumons de la cavité thoracique.

Immergez le tissu dans 37 degrés Celsius RPMI 1640 pour éliminer l’excès de sang. À l'aide de ciseaux et de pinces, coupez la bronche principale de la tige des lobes au niveau du hile et séparez doucement les lobes pulmonaires. Transférez les lobes dans un puits d’une plaque d’imagerie à 24 puits, surface plane vers le bas et recouvrez le tissu avec 100 microlitres de 37 degrés Celsius RPMI 1640. Placez plusieurs lames de microscope circulaire de 15 millilitres sur le dessus des lobes pour les empêcher de flotter, et versez du PBS chaud dans les puits environnants pour empêcher le milieu de s’évaporer. Insérez ensuite la plaque à 24 puits dans la chambre climatique et transférez la chambre sur la platine du microscope confocal.