Culture tridimensionnelle de cellules de carcinome pulmonaire : une méthode pour étudier les interactions cellule-matrice
JoVE Encyclopedia of Experiments
Recherche sur le cancer
0 vues • 4:45 min • April 30th, 2023
- Tout d’abord, décongelez les flacons de matrice de membrane basale à 4 degrés Celsius pendant la nuit. La matrice de la membrane basale est constituée de protéines présentes dans le microenvironnement tumoral qui aident à maintenir les caractéristiques des cellules cancéreuses in vitro. Le lendemain, placez le flacon de matrice à membrane basale sur de la glace pour maintenir la matrice à l’état liquide. Prenez les cellules cancéreuses du poumon dans un tube de centrifugation pré-refroidi et centrifugez-les à 4 degrés Celsius. Aspirez le surnageant et tapotez doucement pour déloger la pastille et placez-la sur de la glace. Ensuite, ajoutez un volume approprié de mélange de membrane basale dans ce tube et mélangez pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. Effectuez toutes les étapes à basse température pour éviter que la membrane basale ne se gélifie.
Transférez un volume approprié de suspension de matrice cellulaire au centre de chaque puits dans une plaque de puits prérefroidie, couvrant l’ensemble du puits. Incuber la plaque de puits pour que la matrice se solidifie. Examinez au microscope pour assurer une distribution uniforme des cellules dans la matrice. Ajoutez un milieu de culture 3D complet dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius. Ce milieu facilite les interactions entre la matrice cellulaire. Ainsi, les cellules forment des organoïdes avec des structures de type acineux. Dans le protocole suivant, nous effectuerons la culture 3D de cellules de carcinome pulmonaire TUM622.
Pour commencer, décongelez les flacons de matrice de membrane basale dans un réfrigérateur à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Refroidissez deux pipettes en plastique d’un millilitre et les pointes à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, réchauffez les réactifs utilisés pour dissocier les cellules TUM622, le tampon HEPES, la trypsine-EDTA et le tampon de neutralisation de la trypsine dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Sortez la matrice de membrane basale décongelée du réfrigérateur et placez le flacon sur de la glace. Refroidissez les plaques de culture tissulaire sur une glacière à plate-forme métallique posée sur de la glace. Placez les tubes à centrifuger sur une grille de refroidissement en métal sur de la glace. Calculer le nombre de cellules nécessaires, en fonction du nombre de puits et de la concentration de cellules dans chaque puits, à préparer. Transférez la suspension de cellules TUM622 dans un tube de centrifugation refroidi et faites-la tourner à 300 fois g dans une centrifugeuse à godets suspendus à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes.
À l’aide d’une pipette d’aspiration fixée à une pointe non filtrée, aspirez soigneusement le surnageant, en laissant environ 100 microlitres de milieu dans le tube. Tapotez doucement sur le côté du tube pour déloger et associer la pastille, puis remettez-la dans la grille de refroidissement. À l’aide des pipettes prérefroidies de deux millilitres, mélangez délicatement la matrice sur de la glace en pipetant de haut en bas à quelques reprises. Pipetez à une vitesse régulière et modérée afin qu’aucune bulle ne soit introduite dans la matrice pendant cette procédure.
Transférez 1,1 millilitre de matrice dans chaque tube de centrifugation. À l’aide d’embouts prérefroidis, pipetez la matrice de chaque tube de haut en bas environ 10 fois pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. Transférez 310 microlitres de suspension à matrice cellulaire dans chaque puits d’une plaque prérefroidie à 24 puits. Placez la pipette à un angle de 90 degrés par rapport à la surface de la plaque et ajoutez la suspension au centre du puits. La suspension s’étend et couvre tout le puits. Pour faciliter l’analyse par immunofluorescence en aval, transférez 60 microlitres de suspension de matrice cellulaire au centre du puits d’une lame de chambre à 2 puits. Cela permet à la matrice de former une structure en forme de dôme avec un volume beaucoup plus petit.
Remettez la plaque et la chambre dans l’incubateur de culture tissulaire et incubez pendant 30 minutes pour permettre à la matrice de se solidifier. Après cela, examinez la plaque et la lame sous un microscope optique pour vous assurer que les cellules individuelles sont uniformément réparties dans la matrice. Ajoutez 1 millilitre de milieu de culture 3D complet préchauffé dans chaque puits de la plaque et 1,5 millilitre de milieu de culture 3D dans chaque puits de la lame de chambre. Remettez-les ensuite dans l’incubateur.
Aperçu
Cet article décrit un protocole de culture en 3D de cellules de carcinome pulmonaire TUM622 à l'aide d'une matrice de membrane basale. La méthode met l'accent sur le maintien d'une température basse pendant la préparation afin d'éviter la gélification de la matrice.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Culture cellulaire
- Biologie du cancer
- Ingénierie tissulaire 3D
Contexte
- La matrice de la membrane basale est cruciale pour maintenir les caractéristiques des cellules cancéreuses in vitro.
- Les cultures en 3D peuvent mieux imiter le microenvironnement tumoral par rapport aux cultures traditionnelles en 2D.
- Les structures d'organoïdes formées en culture tridimensionnelle peuvent fournir des informations sur la biologie du cancer.
- Le contrôle de la température est essentiel pour éviter la solidification prématurée de la matrice.
Objectif de l'étude
- Établir une méthode fiable pour la culture de cellules de carcinome pulmonaire dans un environnement tridimensionnel.
- Faciliter l'étude des interactions cellule-matrice dans la recherche sur le cancer.
- Permettre la formation d'organoïdes présentant des structures semblables à celles des acini pour des analyses ultérieures.
Méthodes utilisées
- Décongélation et préparation de la matrice de la membrane basale à basse température.
- Centrifugation des cellules cancéreuses pulmonaires TUM622 pour former un culot cellulaire.
- Mélange de la suspension cellulaire avec la matrice de la membrane basale.
- Transfert du mélange dans des plaques de puits et incubation pour solidification.
Résultats principaux
- Formation réussie d'une suspension uniforme de cellules dans la matrice.
- Répartition homogène des cellules au sein de la matrice confirmée au microscope.
- Des organoïdes présentant des structures semblables à des acini se sont formés après incubation.
- Le milieu de culture en 3D a favorisé la croissance et les interactions cellulaires.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode reproductible pour la culture tridimensionnelle de cellules de carcinome pulmonaire.
- Le maintien de températures basses est essentiel pour l'intégrité de la matrice.
- Cette approche peut améliorer la compréhension de la biologie du cancer grâce à une modélisation améliorée du microenvironnement tumoral.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet une culture tridimensionnelle reproductible de cellules de carcinome pulmonaire afin de modéliser les interactions cellule-matrice, soutenant ainsi la validation de cibles en découverte de médicaments en oncologie. En formant des structures semblables à des organoïdes dans une matrice de membrane basale, cette méthode améliore la fiabilité prédictive des modèles précliniques en reproduisant plus fidèlement le microenvironnement tumoral. Elle offre un système standardisé et évolutif pour l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux cibles thérapeutiques en recherche sur le cancer du poumon.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des interactions tumeur-stroma et la modulation des voies dans un contexte physiologiquement pertinent.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle des cibles en préservant les caractéristiques des cellules cancéreuses grâce aux signaux provenant de la matrice extracellulaire.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les cibles en réduisant les faux positifs issus des artefacts des cultures artificielles en 2D.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives, basées sur la microscopie, sur la formation d'organoïdes et le développement de structures de type acineuses.
- Valeur opérationnelle : Normalise les conditions de dosage grâce à une préparation de la matrice à température contrôlée et à une distribution uniforme des cellules.
- Évolutivité : Compatible avec des plaques de 24 puits et des lamelles-chambres pour des analyses d'imagerie et d'immunofluorescence à débit moyen à élevé.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et la validation préclinique en modélisant la progression du carcinome épidermoïde du poumon dans un système pertinent pour la maladie.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Permet d'évaluer les effets des composés sur l'adhésion cellule-matrice, l'invasion et la morphogenèse des organoïdes.
- Pertinence prédictive : Renforce la pertinence des résultats précliniques en tenant compte de l'architecture tissulaire tridimensionnelle et des interactions stromales.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, permettant l'évaluation précoce des cibles et l'optimisation des composés candidats grâce à une fidélité biologique améliorée.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses sur les voies de signalisation dépendantes de la matrice et le potentiel tumorigène.
- Criblage : Fournit des résultats d'imagerie quantitatifs et reproductibles pour le criblage de bibliothèques de composés en formats tridimensionnels.
- Analytique : Propose des mesures morphométriques et basées sur la fluorescence afin de comparer les effets des traitements sur la formation d'organoïdes.
- Recherche translationnelle : Permet l'alignement des biomarqueurs en préservant les interactions de l'environnement tumoral essentielles à la progression du cancer.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour le développement de modèles de cancer du poumon dans plusieurs projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la validité prédictive des modèles de cancer du poumon en permettant l'étude des interactions cellules-matrice.
- Valeur opérationnelle : Assure la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés de manipulation des matrices sensibles à la température.
- Valeur stratégique : Réduit le risque d'échec en améliorant la pertinence biologique des évaluations précliniques de l'efficacité et de la toxicité.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions fondées sur les données (go/no-go) grâce à une fidélité accrue des modèles dans les programmes de lutte contre le cancer du poumon.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire en 3D et en manipulation de la matrice extracellulaire.
- Dépend de la logistique de chaîne du froid et d'équipements contrôlés en température pour la préparation de la matrice.
- Exige des procédures opérationnelles normalisées entre les équipes afin d'assurer une formation cohérente des organoïdes.
- L'adaptation à d'autres modèles de carcinome peut nécessiter une optimisation de la concentration de la matrice et de la densité cellulaire.
- Limité par la nécessité d'outils d'imagerie spécialisés pour évaluer les résultats structuraux en 3D.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026