Pourquoi la détermination de la CI50 est-elle essentielle avant l'augmentation des doses ?

L'établissement de la concentration IC50 de référence à l'aide du test MTT fournit la concentration de départ pour l'escalade posologique à 1/10 de l'IC50, garantissant ainsi une pression sélective sans cytotoxicité immédiate. Cela permet un développement progressif de la résistance au fil du temps, plutôt qu'une mort cellulaire aiguë.

Comment le résultat du test MTT permet-il de comprendre le développement de la résistance ?

Le test au MTT mesure la production de formazan par l'activité de la réductase mitochondriale dans les cellules viables, la densité optique à 570 nm étant corrélée au nombre de cellules ; la résistance est confirmée lorsque les cellules maintiennent leur viabilité à des concentrations croissantes d'afatinib qui avaient initialement inhibé la croissance.

Qu'est-ce qui permet une réplication fiable du développement de lignées cellulaires résistantes ?

Une augmentation progressive de la dose à subconfluence, avec des augmentations de concentration de 10 à 20 % à chaque passage, fournit un protocole normalisé de pression sélective qui peut être reproduit dans différents laboratoires afin de générer des modèles isogéniques résistants.

Pourquoi les exigences de réplication sont-elles essentielles à la collaboration transversale ?

Un développement cohérent de la résistance entre les réplicats garantit que les phénotypes observés sont d'origine génétique plutôt que stochastiques, permettant un transfert fiable entre les équipes de découverte, de développement de tests et précliniques pour les études de validation de cibles.

Quelle analyse statistique est nécessaire pour confirmer le développement d'une résistance ?

La résistance est confirmée en comparant les courbes de viabilité issues du test au MTT entre les cellules parentales et les cellules exposées à des doses croissantes, en effectuant un test de significativité statistique (par exemple, analyse du décalage de la CI50) afin de démontrer une sensibilité réduite au médicament au fil du temps.

Escalade de dose : une méthode pour développer une résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses

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0 vues • 4:17 min • April 30th, 2023

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- Les inhibiteurs de la tyrosine kinase, TKI, empêchent le récepteur kinase de se lier à l’ATP, empêchant ainsi la phosphorylation. Commencez par ensemencer les cellules cancéreuses dans un milieu de croissance. Permettez-leur d’atteindre une densité favorable et transférez les cellules dans plusieurs puits. Après une nuit de croissance, distribuez différentes concentrations de médicament dans plusieurs puits et laissez les cellules se développer pendant la durée souhaitée. Ajoutez du MTT, un colorant soluble dans l’eau, pour mesurer la viabilité cellulaire. Les enzymes mitochondriales convertissent le MTT en formazan violet insoluble à l’intérieur des cellules vivantes.

Arrêtez la réaction en ajoutant un agent solubilisant approprié et mesurez le formazan par spectrophotométrie. Cette méthode s’appelle le test MTT. Tracez un graphique des cellules vivantes indiquées par le formazan en fonction des concentrations de médicaments. Calculez la concentration inhibitrice, IC₅₀, en trouvant la concentration de médicament qui tue 50 % des cellules à l’aide du logiciel.

Ensuite, cultivez des cellules cancéreuses dans le milieu de croissance et répartissez-les dans trois plaques différentes. Une fois que les cellules ont atteint la sous-confluence, ajoutez une dilution de 1/10 de la concentration d’IC₅₀. Laissez les cellules se développer et effectuez le test MTT. Répétez ce processus avec une dose croissante de médicament. Les cellules cancéreuses développent lentement une résistance aux ITK en raison de mutations dans la séquence protéique.

Le protocole suivant montre le développement d’une résistance à l’afatinib dans les cellules PC9 par escalade de dose.

- Pour déterminer la concentration appropriée de résistance à l’afatinib, cultivez des cellules PC9 dans un milieu de croissance dans une boîte de 10 centimètres traitée par culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Remettez les cellules PC9 en suspension à une concentration de 4 fois 10 à 4 cellules par millilitre de milieu de croissance et ensemencez les cellules à 50 microlitres de cellules en suspension par puits dans une microplaque de 96 puits. Après une nuit d’incubation dans l’incubateur de culture cellulaire, traiter les cellules avec 50 microlitres de solution d’afatinib par puits à six répétitions des concentrations indiquées. Et après une incubation de 96 heures dans l’incubateur de culture cellulaire, ajoutez 15 microlitres de colorant MTT dans chaque puits.

Après quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire, ajoutez 100 microlitres de solution d’arrêt de solubilisation dans chaque puits et remettez la plaque dans l’incubateur pendant la nuit. Le lendemain matin, mesurez la densité optique à 570 nanomètres sur un lecteur de microplaques. Pour une exposition continue à l’afatinib, cultivez les cellules PC9 dans des boîtes P100 contenant 10 millilitres de milieu de culture jusqu’à ce que les cellules atteignent la sous-confluence.

Transférez les cultures sous-confluentes dans trois nouvelles boîtes P100 de 9 millilitres de milieu de croissance par boîte de culture initiale et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, ajoutez 0,1 nanomolaire ou 1/10 de la concentration inhibitrice demi-maximale d’afatinib à chaque série de trois boîtes de culture. Lorsque les cellules traitées à l’afatinib deviennent subconfluentes, utilisez une pipette de 1 millilitre pour bien mélanger les cultures et transférez 1 millilitre de cellules de chaque boîte à 9 millilitres de milieu de croissance frais dans des boîtes neuves P100.

Ajouter des concentrations plus élevées de 10 % à 20 % d’afatinib aux nouvelles cultures, en augmentant la concentration d’afatinib par augmentation progressive de la dose chaque fois que les cultures atteignent une sous-confluence sur une période de 10 à 12 mois. Lorsqu’une concentration d’afatinib de 1 micromolaire est atteinte, effectuer le test MTT tel qu’il a été démontré pour confirmer que les cellules ont développé une résistance à l’afatinib.