Dosage de l’extraction d’ARN : une méthode pour extraire de l’ARN de cellules cancéreuses du poumon transfectées par des miARN

- Pour commencer, ensemencez les cellules cancéreuses du poumon dans une fiole en T contenant un milieu de culture tissulaire et laissez-la croître pendant la nuit. Ensuite, suspendez le miARN avec un agent transfecteur dans un milieu transfecteur. Retirez le milieu et ajoutez un milieu transfecteur qui introduira des miARN dans les cellules cancéreuses. Le miARN est une molécule d’ARN non codante qui se lie à une séquence d’ARNm complémentaire et bloque l’expression des gènes. Incuber le ballon pendant la durée souhaitée.

Ensuite, remplacez le milieu par un milieu de culture tissulaire et cultivez pendant la nuit. Ajouter de la trypsine pour la dissociation cellulaire. Transférez le mélange dans un tube à centrifuger contenant du PBS et centrifugez-le. Retirez le surnageant et ajoutez un tampon de lyse pour lyser les cellules et ajoutez de l’éthanol ultra pur pour la précipitation. Placez le mélange dans une colonne de séparation pour purifier l’acide nucléique et centrifugez.

Retirez le flux et ajoutez un tampon de lavage pour éliminer la membrane cellulaire lysée et centrifugez. Retirez le tampon de lavage et ajoutez de la DNase avec le tampon de digestion DNase pour éliminer l’ADN de l’échantillon et de la centrifugeuse. Ajouter un tampon de préparation d’ARN pour isoler l’ARN et centrifuger. Recueillir l’ARN présent dans le surnageant. Dans le protocole suivant, nous effectuerons l’extraction d’ARN à partir de cellules cancéreuses du poumon traitées par miARN.

- Tout d’abord, ensemencez les cellules cancéreuses dans un flacon approprié suffisant pour l’extraction de l’ARN et des protéines afin d’effectuer l’expression génique à l’aide de la qPCR ou de l’analyse par microréseau. Ensuite, incuber pendant la nuit avec un milieu complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.

Le lendemain, préparez l’échantillon de microARN pour la transfection en diluant le microARN 143 et le microARN 506 dans le milieu, à une concentration de 100 nanomolaires chacun. Sortez la fiole de l’incubateur et retirez le support. Laver avec 1 x PBS.

Tous les témoins non traités ne contiendront que des milieux incomplets avec des cellules. Incuber les cellules avec un milieu de transfection pendant six heures dans un incubateur. Au bout de six heures, retirez le support et remplacez-le par 4 millilitres de support complet frais. Récoltez les cellules après 24 heures et 48 heures par trypsinisation.

Ensuite, lavez deux fois avec 1 fois PBS dans chaque tube et retirez le surnageant. Afin d’effectuer l’extraction de l’ARN plus tard, congelez les cellules à moins 80 degrés Celsius.

- L'extraction de l'ARN a été effectuée à l'aide d'un kit d'ARN, conformément aux instructions du fabricant. Retirez d’abord les tubes à moins 80 degrés Celsius et laissez-les décongeler.

- Ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse et pipetez de haut en bas pour briser la membrane cellulaire. Ajoutez un volume égal d’éthanol ultra pur à 100 %. Ensuite, mélangez bien et placez dans la colonne de séparation. Centrifugez et retirez le flux.

Ajoutez 400 microlitres de tampon de lavage et centrifugez pour retirer le tampon. Ajoutez 5 microlitres d’ADN I avec 75 microlitres de tampon de digestion d’ADN dans chaque échantillon et incubez pendant 15 minutes. Lavez ensuite l’échantillon avec un tampon de préparation d’ARN de 400 microlitres.

Ensuite, lavez deux fois avec un tampon de lavage ARN. Ajoutez maintenant de l’eau sans nucléases dans la colonne, centrifugez, puis collectez l’ARN. Mesurer la concentration en ARN, à ce stade, 2 microgrammes d’échantillon d’ARN peuvent être envoyés pour le séquençage de l’ARN.