JoVE Encyclopedia of Experiments
Recherche sur le cancer
0 vues • 3:02 min • April 30th, 2023
- Commencez par ajouter une solution de biotine et un tampon de marquage à l’échantillon de protéines. Incuber pour faciliter la fixation de la biotine aux protéines. Ajoutez un réactif d’arrêt et un vortex. Ensuite, placez une lame de microréseau d’anticorps dans une boîte contenant un réactif bloquant pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps. Lavez la lame avec de l’eau distillée deux fois pour éliminer la solution de blocage. Placez la lame de la puce dans une chambre. Mélangez l’échantillon de protéines biotinylées avec une solution de couplage et ajoutez-le sur la lame pour faciliter la liaison des protéines cibles à leurs anticorps correspondants. Transférez la lame dans un plat contenant un tampon de lavage et remplacez le tampon par de l’eau distillée doublement. Ensuite, placez la lame dans un tampon de détection contenant de la streptavidine marquée par fluorescence pour favoriser sa liaison aux protéines biotinylées.
Incuber la parabole dans l’obscurité pour maintenir l’intensité de la fluorescence. Retirez la lame et placez-la dans un scanner de microréseaux. Le scanner recherche des signaux fluorescents provenant de la streptavidine liée à la protéine cible. En fonction de l’intensité de la fluorescence, le logiciel analyse l’étendue de l’expression des protéines. Dans le protocole suivant, nous effectuons une micropuce à anticorps pour analyser les altérations de l’expression génique associées au cycle cellulaire.
- Cette expérience vise à identifier toutes les modifications d'expression des protéines de la voie du cycle cellulaire par le traitement par microARN. Prélever des échantillons de protéines selon la procédure décrite dans la section sur la transfection et quantifier avec le dosage de l’ACB. Retirez les lames à moins 4 degrés Celsius une heure avant l’expérience pour les amener à température ambiante et pour éliminer l’humidité. Prélever 70 microgrammes d'échantillons de protéines et préparer les lames d'échantillon selon les instructions du fabricant, qui sont également décrites étape par étape dans la section texte.
Il convient de noter qu’un bon lavage des lames avec de l’eau déminéralisée ultrapure est une autre étape importante car cela aidera à réduire l’arrière-plan des diapositives. De plus, il est très important dans cette expérience de ne pas assécher les lames d’échantillon jusqu’à l’étape finale. Enfin, numérisez la lame à l’aide d’une machine à microréseaux et analysez les données.