Préparation d’échantillons de tumeurs fixées au formol et enrobées de paraffine : un protocole pour préserver les échantillons de tissus et de cytologie du cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC)
JoVE Encyclopedia of Experiments
Recherche sur le cancer
0 vues • 3:39 min • April 30th, 2023
- Pour commencer, obtenez des échantillons de tumeurs pulmonaires sous forme d’échantillons de tissus ou d’échantillons cytologiques à partir de lavages bronchiques - un lavage salin contenant des cellules de l’intérieur des voies respiratoires. Pour préparer des échantillons de tissus, transférez des tissus pulmonaires fraîchement disséqués dans une cassette d’enrobage. Fixez et préservez le tissu avec la concentration appropriée de formol.
Pour préparer des échantillons de cytologie, il faut d’abord traiter les lavages bronchiques avec du DL-dithiothréitol pour l’homogénéisation. Centrifugez et retirez le surnageant. Ensuite, traitez avec une solution mucolytique pour liquéfier le mucus et séparer les cellules. Centrifugeuse pour granuler les cellules et les fixer avec du formol. Traitez les cellules avec un réactif de préparation de bloc cellulaire approprié pour concentrer l’échantillon tout en travaillant avec de petits volumes de granulés.
Transférez le granulé dans une cassette d’encastrement. Traitez les deux types d’échantillons en les déshydratant à travers une série de bains d’alcool gradués. Éliminez l’alcool à l’aide d’un agent nettoyant approprié suivi d’une infiltration de cire. Incorporez la cassette dans de la cire de paraffine liquide et laissez-la se solidifier. Cela forme une couche autour du tissu, maintenant l’échantillon en place.
À l’aide d’un microtome, vous obtiendrez des tronçons finement tranchés. Placez les sections sur des lames de verre chargées positivement pour faciliter l’adhérence. Sécher et teindre pour observer les lames au microscope. Dans le protocole suivant, nous démontrons des techniques de préparation d’échantillons à partir d’échantillons de tissus tumoraux pulmonaires et d’échantillons cytologiques.
Pour commencer, fixez le tissu tumoral dans du formol tamponné neutre à 10 % dans une cassette et intégrez la cassette dans de la paraffine comme indiqué dans le protocole de texte. Incorporez le tissu infiltré dans un moule rempli de paraffine fondue. Laissez les tissus rester dans le moule jusqu’à ce que la paraffine se solidifie. Après cela, utilisez un microtome pour sectionner le tissu inclus dans la paraffine à une épaisseur de trois micromètres.
Transférez le ruban de paraffine sur une lame de microscope en verre chargé positivement. Ensuite, séchez la lame pendant une heure à 37 degrés Celsius. Tout d’abord, recueillez les lavages bronchiques dans une solution de préservation. Transférez les lavages dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez deux grammes de DL-dithiothreitol et agitez le tube pendant 30 minutes. Puis centrifuger à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.
Retirez le surnageant et ajoutez 10 millilitres d’une solution mucolytique. Agiter l’échantillon à vitesse moyenne pendant 20 minutes et centrifuger à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Après cela, retirez le surnageant et déposez la pastille de cellule dans un tube de collecte contenant 10 % de formol tamponné neutre.
Ajouter quatre gouttes d’un agent de préparation de bloc cellulaire. Transférez la pastille de cellule dans une cassette. Fixez la pastille cellulaire pour l’enrobage et la section de la paraffine en utilisant le processus décrit précédemment pour la préparation d’échantillons de tissu tumoral.
Aperçu
Cet article décrit les techniques de préparation des échantillons de tumeurs pulmonaires et des prélèvements de cytologie. Il détaille les procédés de fixation, d'inclusion et de sectionnement de ces échantillons en vue de leur examen microscopique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Pathologie
- Histologie
Contexte
- Les tumeurs pulmonaires peuvent être analysées à l’aide d’échantillons de tissus et d’échantillons cytologiques.
- La préparation adéquate des prélèvements est essentielle pour un diagnostic précis.
- La fixation au formol et l’encapsulation en paraffine sont des pratiques courantes.
- L’examen microscopique nécessite une sectionnement précis des échantillons.
Objectif de l'étude
- Démontrer des méthodes efficaces pour la préparation d'échantillons de tumeurs pulmonaires.
- Garantir des échantillons de haute qualité destinés à l'analyse histologique.
- Fournir un protocole pouvant être reproduit dans des contextes de recherche.
Méthodes utilisées
- Prélèvement d'échantillons de tumeurs pulmonaires et de lavages bronchiques.
- Fixation des échantillons dans le formol et inclusion dans la paraffine.
- Coupes de tissus inclus dans la paraffine à l'aide d'un microtome.
- Coloration des coupes pour l'observation microscopique.
Résultats principaux
- Préparation réussie d'échantillons tissulaires et cytologiques.
- Les techniques démontrées produisent des lames de haute qualité pour l'analyse.
- Les protocoles peuvent être adaptés à différents types de prélèvements pulmonaires.
- Des méthodes efficaces améliorent la fiabilité des résultats histologiques.
Conclusions
- Une préparation adéquate des échantillons est essentielle pour l'analyse des tumeurs pulmonaires.
- Les méthodes décrites sont reproductibles et efficaces.
- De futures études pourront s'appuyer sur ces techniques afin d'améliorer les diagnostics.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet une préservation fiable des échantillons de tissus et de cytologie de CBNPC, soutenant des analyses de biomarqueurs en aval telles que l'immunohistochimie de la PD-L1. Une fixation standardisée au formol et un inclusion en paraffine garantissent l'intégrité des échantillons pour l'évaluation histopathologique, essentielle à la validation des cibles dans le développement de médicaments en immuno-oncologie. La méthode facilite un découpage et une coloration constants, permettant une évaluation microscopique reproductible au sein des flux de travail de découverte et précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Préserve la morphologie tumorale et l'antigénicité pour une évaluation précise des biomarqueurs dans les modèles de CBNPC.
- Valeur opérationnelle : Permet le traitement parallèle d'échantillons tissulaires et de spécimens de cytologie provenant de la même cohorte de patients.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des sections uniformes adaptées à la coloration immunohistochimique et à l'analyse quantitative d'images.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation des tests en minimisant la variabilité pré-analytique lors de la préparation des échantillons.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve l'architecture cytologique des lavages bronchiques, permettant une corrélation entre les biopsies liquides et les biomarqueurs tissulaires.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole standardisé pour la biobanque d'échantillons de CBNPC à travers différents sites de recherche.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux pipelines de découverte du CBNPC en permettant la confirmation histopathologique de l'expression de la cible avant les essais fonctionnels.
- Biologie de la découverte : Garantit l'intégrité des échantillons pour valider PD-L1 ou d'autres cibles de points de contrôle immunitaires dans les modèles de cancer du poumon.
- Depistage : Fournit des sections reproductibles pour le criblage d'anticorps et la quantification de biomarqueurs.
- Analytique : Génère des lectures histologiques quantifiables afin de corréler l'expression de la cible avec la réponse au médicament.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre l'analyse cytologique et l'analyse tissulaire, assurant la continuité des biomarqueurs depuis la détection précoce jusqu'à la validation préclinique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un protocole opératoire standardisé transférable pour la manipulation des échantillons de CBNPC au sein des équipes de découverte, de recherche translationnelle et préclinique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit les artefacts préanalytiques susceptibles de fausser les données d'expression des cibles.
- Valeur opérationnelle : Permet le traitement à haut débit d'échantillons de biopsies et de cytoponctions de CBNP.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les décisions de poursuite ou d'abandon en assurant une évaluation fiable des biomarqueurs.
- Impact sur le portefeuille : Soutient l'avancement ciblé des candidats en immuno-oncologie selon des données histopathologiques cohérentes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise en histopathologie pour une fixation, une inclusion et une coupe adéquates.
- Accès aux microtomes, aux appareils de traitement des tissus et aux postes d'inclusion.
- Protocoles normalisés concernant la concentration de formol et les durées d'infiltration par la paraffine.
- Prise en compte des adaptations nécessaires selon la taille des échantillons, biopsies ou culots cytologiques.
- Étapes de contrôle qualité permettant d'évaluer l'intégrité des coupes et la fidélité de la coloration avant toute analyse en aval.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel
Vidéos connexes
0 Vues
Automated panneau Multiplex Immunofluorescence pour des études sur des échantillons de tissus fixés au formol carcinome Immuno-oncologie
Vidéos connexes
0 Vues
Radiosensibilité des cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires du cancer du poumon
Vidéos connexes
0 Vues
Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné
Vidéos connexes
0 Vues
Préservation des tissus enrobés de paraffine fixée au formol (FFPE) : une méthode pour étudier la morphologie des tissus
Vidéos connexes
0 Vues
Protéomique Préparation de l'échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus
Vidéos connexes
0 Vues
Travailler avec les tissus humains pour la recherche translationnelle sur le cancer
Vidéos connexes
0 Vues
Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d'extraction d'ADN
Vidéos connexes
0 Vues
Protocole pour HER2 pêcher avec un fixateur de tissu Non-cross-linking, formol à combiner les avantages de Cryo-préservation et Fixation au formol
Vidéos connexes
0 Vues
Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 22 août 2026