Essai de formation de colonies : évaluation de l’efficacité des agents anticancéreux sur les cellules cancéreuses du poumon formant des colonies
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Recherche sur le cancer
0 vues • 4:11 min • April 30th, 2023
- Le test de formation de colonies est une analyse in vitro d'un médicament anticancéreux sur la croissance de la cellule cancéreuse, proliférant et se différenciant en colonies dans des milieux semi-solides. Pour commencer, ensemencez les cellules cancéreuses dans le milieu RPMI avec un supplément de croissance - sérum fœtal bovin, ou FBS, et antibiotique. Incuber les cellules pendant la durée requise.
Ensuite, collectez la concentration souhaitée de cellules dans un tube à microfuge et centrifugez. Remettez le granulé en suspension dans le PBS. Préparez un milieu à base de méthylcellulose et distribuez-le dans différents tubes avec FBS pour favoriser une croissance optimale.
Ajoutez une quantité appropriée de suspension cellulaire dans des tubes et vortexez-les pour mélanger les cellules avec le milieu. Ensuite, ajoutez des composés anticancéreux dans des tubes et préparez un contrôle en ajoutant du DMSO. Tubes vortex.
Ajoutez ce mélange de cellules dans la plaque de culture et incubez pendant la durée souhaitée. Après l’incubation, ajoutez du bromure de méthylthiazol diphényltétrazolium, ou MTT, et incubez pendant un certain temps. Le MTT réduit le sel jaune de tétrazolium dans les cellules viables en cristaux de formazan violets. Les colonies viables virent au violet. Capturez les images à l’aide d’un appareil photo numérique et analysez les colonies viables. Dans le protocole suivant, nous étudierons un test de formation de colonies pour évaluer l’activité des mimétiques de l’hydroxycoumarine OT48 et BH3 dans le cancer du poumon.
- Pour commencer, plaquez 20 000 cellules A549 par centimètre carré dans 15 millilitres de milieu de culture cellulaire RPMI 1640, complété par 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques dans une fiole de 75 centimètres carrés. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le jour de l’expérience, utilisez un hémocytomètre pour déterminer la concentration cellulaire.
Recueillir 50 000 cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre par centrifugation à 400 G pendant sept minutes. Et remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS 1X stérile. À l’aide d’une multipipette, versez 1,1 millilitre de milieu semi-solide à base de méthylcellulose, ou MCBM, dans des tubes, en préparant un tube pour chaque condition. Ajoutez ensuite 110 microlitres de FBS dans chaque tube.
Ensuite, ensemencez 1 000 cellules par millilitre. Ensuite, pipetez 2,4 microlitres de la solution de cellule mère dans les tubes de MCBM et de FBS. Après avoir ajouté les cellules, tenez les tubes verticalement et tourbillonnez-les à la vitesse la plus élevée pendant une minute pour bien mélanger le MCBM et les cellules.
Ajoutez maintenant le composé d’essai OT48 seul, ou en combinaison avec A1210477, aux échantillons. Préparez un tube séparé comme contrôle pour le solvant utilisé, tel que le DMSO. Ensuite, faites tourbillonner les échantillons pendant une minute.
Pour chaque dosage, pipeter un millilitre du mélange dans le puits central d’une plaque de culture cellulaire à 12 puits. Utilisez ensuite un millilitre d’eau stérile ou de PBS pour remplir les puits vides. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 10 jours. Ajoutez ensuite 200 microlitres d’une solution mère de MTT de cinq milligrammes par millilitre dans chaque puits. Après avoir incubé les plaques pendant 10 minutes, vérifiez s’il y a des colonies viables, qui deviendront violettes.
Aperçu
Le test de formation de colonies est une méthode in vitro essentielle pour évaluer les effets des médicaments anticancéreux sur la croissance des cellules cancéreuses. Ce protocole décrit les étapes permettant d'évaluer l'activité de l'hydroxycoumarine OT48 et des analogues BH3 dans le cancer du poumon à l'aide de cellules A549.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur le cancer
Contexte
- Le test de formation de colonies mesure la capacité des cellules cancéreuses à croître et à former des colonies.
- Il utilise des milieux semi-solides pour soutenir la prolifération et la différenciation cellulaires.
- Le test au MTT est utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire en fonction de changements colorimétriques.
- Cette étude porte sur des lignées cellulaires de cancer du poumon et sur des composés anticancéreux spécifiques.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'efficacité de l'hydroxycoumarine OT48 et des analogues BH3.
- Déterminer l'impact de ces composés sur la croissance des cellules cancéreuses du poumon A549.
- Fournir un protocole détaillé pour la réalisation du test de formation de colonies.
Méthodes utilisées
- Ensemencer les cellules A549 dans du milieu RPMI contenant du FBS et des antibiotiques.
- Préparer un milieu à base de méthylcellulose pour une croissance cellulaire optimale.
- Ajouter les composés anticancéreux et le solvant témoin aux mélanges cellulaires.
- Incuber et évaluer la viabilité cellulaire à l’aide du test au MTT.
Résultats principaux
- Les colonies viables sont identifiées par la formation de cristaux violets de formazane.
- Le test permet la quantification de la formation de colonies en réponse à des traitements.
- Les résultats indiquent l'efficacité potentielle des OT48 et des analogues de BH3 dans le traitement du cancer du poumon.
- Les images des colonies fournissent une confirmation visuelle des effets des traitements.
Conclusions
- Le test de formation de colonies est un outil efficace pour évaluer l'efficacité des médicaments anticancéreux.
- L'hydroxycoumarine OT48 montre des résultats prometteurs pour l'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses du poumon.
- Ce protocole peut être adapté à diverses lignées cellulaires cancéreuses et à différents traitements.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
Le test de formation de colonies fournit une mesure quantitative et reproductible de l'efficacité des agents anticancéreux en évaluant la capacité proliférative de cellules cancéreuses du poumon dans un milieu semi-solide. Ce test soutient la validation de cibles et l'identification de composés candidats en permettant une comparaison directe des effets des composés sur le nombre et la taille des colonies, ce qui éclaire les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin dans les flux précliniques en oncologie. Sa compatibilité avec l'imagerie à haut contenu et les colorations de viabilité facilite son intégration dans des cascades de criblage destinées à réduire les risques mécanistiques et à hiérarchiser les portefeuilles de projets.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en mesurant les variations de la survie clonogénique après un traitement par un composé.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle d'agents anticancéreux grâce à une réduction dépendante de la dose de la formation de colonies.
- Valeur prédictive : Aide au choix des modèles précliniques en identifiant les composés présentant des effets inhibiteurs durables sur le potentiel tumorigénique.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l'emploi du test : Génère des résultats standardisés et quantifiables (nombre et taille des colonies) adaptés à un criblage de débit intermédiaire.
- Reproductibilité : Utilise des densités définies d'ensemencement cellulaire et des milieux semi-solides afin de minimiser les variations entre réplicats.
- Réutilisation de la plateforme : Adaptable à plusieurs lignées cellulaires de cancer du poumon et à diverses classes de composés, notamment les mimétiques BH3 et les dérivés de produits naturels.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise le potentiel clonogène des cellules cancéreuses pulmonaires A549, un système préclinique clé pour l'adénocarcinome.
- Continuité translationnelle : Relie les résultats in vitro à la validation par xénogreffe ultérieure en confirmant l'activité anti-proliférative.
- Progression ajustée au risque : Guide l'optimisation des candidats-médicaments en identifiant les composés qui suppriment la capacité proliférative à long terme.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test de formation de colonies fonctionne comme un outil intermédiaire de découverte qui suit le criblage initial de cytotoxicité et précède les études d'efficacité in vivo, établissant un lien mécanistique entre l'interaction avec la cible et le résultat phénotypique.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques en associant le traitement par des composés à une réduction de la survie clonogénique, indiquant des effets sur l'auto-renouvellement ou la prolifération.
- Criblage : Fournit des lectures quantitatives basées sur l'imagerie permettant la confirmation des composés actifs et l'analyse des relations structure-activité.
- Analytique : Génère des mesures finales (nombre, taille et viabilité des colonies) qui permettent des comparaisons statistiques entre les groupes traités.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux flux de travail précliniques en validant l'activité anti-tumorale avant les tests d'xénogreffe chez le zebrafish ou la souris.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une méthode standardisée et réutilisable pour évaluer les agents anticancéreux dans divers programmes de découverte en oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit des éclaircissements mécanistiques sur les effets antiprolifératifs durables, réduisant ainsi l'ambiguïté dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation des tests grâce à des quantités cellulaires fixes, une composition définie du milieu et une incubation temporellement contrôlée.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en privilégiant les composés présentant des effets durables sur la croissance clonogénique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en distinguant les composés cytostatiques des composés cytotoxiques selon leur capacité à supprimer la formation de colonies.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, en technique stérile et en optimisation des tests de viabilité.
- Suppose l'accès à des incubateurs, des centrifugeuses et des plateformes colorimétriques ou d'imagerie pour la détection des colonies.
- Exige une harmonisation entre équipes sur les protocoles de comptage des colonies et les seuils d'analyse d'images.
- Doit tenir compte de la variabilité dans la préparation des milieux semi-solides et de la solubilité des composés dans les témoins contenant du DMSO.
- Limité aux lignées cellulaires adhérentes et clonogéniques ; n'est pas applicable aux cultures non adhérentes ou en suspension.
F.A.Q. sur les biopharmaceutiques
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Dernière mise à jour : 29 août 2026