Dosage de la xénogreffe de poisson-zèbre : une méthode pour évaluer l’efficacité anticancéreuse des produits thérapeutiques sur la tumorigénicité chez le poisson-zèbre in vivo

- Tout d'abord, placez les œufs dans une plaque de Pétri et ajoutez la solution de Danieau pour conserver les œufs fraîchement récoltés. Ajoutez de la phénylthiourée pour inhiber la pigmentation et incubez pendant quelques jours. Après l’incubation, déchorionnez les embryons à l’aide de pinces tranchantes et laissez-les grandir davantage.

Ensuite, ensemencez le nombre souhaité de cellules cancéreuses dans un flacon de culture et incubez pendant la nuit. Ajoutez maintenant des composés anticancéreux et incubez davantage. Après l’incubation, ajoutez un colorant fluorescent pour traqueur de cellules, qui se liera à la membrane cellulaire et colorera les cellules.

Ensuite, ajoutez de la trypsine pour la dissociation cellulaire et diluez les cellules dans la solution de PBS rouge de phénol avant la procédure d’évaluation du pH. Montez des embryons de poisson-zèbre anesthésiés sur une plaque de gélose. Chargez maintenant le microcapillaire avec une suspension de cellules cancéreuses et injectez-le dans le sac vitellin des embryons.

Transférez les embryons dans des plaques de culture contenant la solution de Danieau et incuberez davantage. Ensuite, transférez quelques embryons sur une lame de verre et ajoutez de la méthylcellulose pour les immobiliser. Placez la lame sous un microscope à fluorescence et quantifiez la taille de la tumeur à l’aide du logiciel.

Les composés anticancéreux inhibent généralement la capacité de formation de tumeurs des cellules cancéreuses. Dans le protocole suivant, nous étudierons l’effet de l’hydroxycoumarine, ainsi que du mimétique BH3, sur la formation de tumeurs chez le poisson-zèbre in vivo.

- Après avoir ensemencé les cellules A549 et les avoir incubées avec des composés conformément au protocole textuel, 24 heures avant la fin du traitement, ajoutez quatre micromolaires du colorant fluorescent CM-Dil pour colorer les cellules et les incuber pendant deux heures.

Après l’incubation, utilisez 0,05 % de trypsine EDTA pour trypsiniser les cellules. Diluez ensuite 10 à 6 cellules dans 50 microlitres de solution de PBS rouge de phénol avant l’injection. Pour effectuer une micro-injection de cellules cancéreuses, tirez un capillaire en verre de 1,0 millimètre à l’aide des paramètres de programme suivants.

À l’aide d’une seringue, coupez le capillaire afin de produire un bord tranchant. Chargez ensuite le microcapillaire avec 20 microlitres de la solution de rouge de phénol cellulaire. Après avoir anesthésié le poisson-zèbre selon le protocole textuel, injectez 100 à 200 cellules dans le sac vitellin en injectant 6 à 10 nanolitres via trois à cinq injections.

- Les micro-injections doivent être effectuées avec beaucoup de soin et de précision pour s’assurer que le bon volume de cellules est injecté, que les dommages causés par l’injection sont minimes et que la pression du dioxyde de carbone doit être optimale pour éviter la létalité des poissons.

- Après l'injection, laissez le poisson récupérer pendant 10 à 30 minutes dans 5 millilitres de solution fraîche de Danieau contenant du PTU. Transférez le poisson dans des plaques à 24 puits avec un millilitre de solution PTU de Danieau et incubez-les à 28,5 degrés Celsius pendant 72 heures. Suite à l’incubation, après avoir anesthésié les poissons selon le protocole de texte, immobilisez-les sur une lame de verre avec une goutte de 3 % de méthylcellulose.