$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Les microARN, ou miARN, sont de petits ARN non codants impliqués dans la régulation des gènes. Leurs expressions sont modifiées au cours du cancer et sont donc des biomarqueurs potentiels du cancer. Pour commencer l’isolement des miARN, prélevez un échantillon de sang total fraîchement prélevé et centrifugez-le à 4 degrés Celsius pour séparer le plasma des cellules sanguines. Transférez le surnageant dans un tube frais et centrifugez-le à nouveau pour obtenir un surnageant plasmatique plus clair. Extraire le surnageant, traiter avec une solution d’homogénéisation réfrigérée, suivie d’un tampon de lyse pour homogénéiser l’échantillon. Ajouter une solution enzymatique de protéinase K pour dégrader les protéines, en particulier les nucléases qui digéreraient autrement l’ARN pendant les étapes en aval.
- Ensuite, chargez le lysat dans le puits désigné d’une cartouche d’extraction d’acide nucléique pré-assemblée spécifique à l’instrument. Ajouter la solution de DNase 1 dans le puits approprié pour éliminer l’ADN génomique de l’échantillon. Ajoutez de l’eau exempte de nucléases dans le tube d’élution assemblé sur la cartouche pour le conditionnement avant l’isolement des miARN. Chargez l’ensemble de cartouche dans l’extracteur d’acide nucléique. Sélectionnez et exécutez le logiciel de purification de miARN approprié. Une fois terminé, retirez le tube d’élution contenant le miARN et stockez-le à moins 80 degrés Celsius.
- Dans le protocole suivant, nous montrons l’extraction de miARN à partir d’échantillons de sang de patients pour le dépistage du cancer du poumon.
- Pour commencer ce protocole, utilisez des tubes de vacutainer pour prélever 10 millilitres d’échantillon de sang total. Conserver à température ambiante.
- Ne stockez pas le sang total à basse température, par exemple 4 degrés Celsius, pour éviter les chocs thermiques et la lyse cellulaire qui entraînent une libération de microARN non spécifiques.
- Centrifugez le plasma dans l’heure qui suit pour le séparer. Tout en veillant à éviter tout contact avec l’anneau lymphocytaire, transférez le surnageant dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez le surnageant dans les mêmes conditions. Aliquote 1 millilitre de ce surnageant plasmatique dans des cryoflacons de 1,5 millimètre, en prenant soin d’éviter de collecter la fraction plasmatique du fond du tube. Pour commencer l’isolement de l’ARN, ajoutez 200 microlitres de solution OMG pré-refroidie à 200 microlitres de plasma pour chaque échantillon. Pour assurer une homogénéisation complète, agiter pendant 15 à 30 secondes. Pour homogénéiser l’échantillon, ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse et 25 microlitres de protéinase K par échantillon et agitez pendant 20 secondes.
- Ensuite, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius dans un thermomélangeur pendant 15 minutes. Ensuite, sélectionnez la méthode du tissu miARN RSC et chargez une cartouche pour chaque échantillon sur un plateau de pont d’un extracteur automatique d’acides nucléiques, en plaçant correctement le piston. Transférez le lysat et ajoutez 5 microlitres de solution de DNase 1 à leurs positions appropriées dans la cartouche de l’instrument. À la base de chaque tube d’élution, ajoutez 60 microlitres d’eau sans nucléases. Pour commencer la purification automatique, lancez la course. Conservez les échantillons d’ARN totaux à moins 80 degrés Celsius.