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- Commencez par placer une mince section de tissu dans une solution d’ammoniac pour permettre une récupération douce de l’antigène. Transférez la section sur une lame recouverte de polylysine. Les cellules chargées négativement se lient à la polylysine chargée positivement. Ensuite, ajoutez du peroxyde d’hydrogène pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase. Lavez la lame dans une solution saline Tris-Buffered, TBS.
Le TBS favorise l’accès des anticorps aux antigènes en brisant les réticulations protéiques. Lavez la section avec une solution en bloc pour réduire la liaison des anticorps non spécifiques. Ajoutez les anticorps primaires à la section et incubez pendant la nuit. L’anticorps primaire se lie à son antigène spécifique présent à la surface de la cellule. Lavez la diapositive avec du TBS.
Ajoutez des anticorps secondaires conjugués à la biotine qui se fixent à la région Fc de l’anticorps primaire. Lavez la section avec l’enzyme streptavidine-biotine peroxydase. Ensuite, ajoutez le substrat chromogène de la peroxydase au tissu. La peroxydase convertit le chromogène en un produit insoluble coloré.
Contre-colorez le tissu avec une solution d’hématoxyline. L’hématoxyline se lie aux composants acides des cellules et les rend bleues. Observez le tissu au microscope optique. Les antigènes sont détectés en rouge tandis que les cellules apparaissent bleues en raison de l’hématoxyline. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une coloration immunohistochimique pour identifier les cellules CD45 et CD1a à partir de biopsies endobronchiques.
- Avant de sectionner le tissu de biopsie intégré, ajustez soigneusement le porte-couteau dans l’angle du bloc de biopsie de sorte que la lame repose à plat contre la surface du bloc. Ensuite, coupez lentement au moins deux sections de 2 microns d’épaisseur dans chaque échantillon de biopsie endobronchique, à l’aide d’une pince pour transférer chaque tranche de tissu fraîchement coupée dans une solution d’ammoniac à 0,05 % et d’eau distillée. Après 45 à 90 secondes, utilisez une lame de microscope recouverte de poly-l-lysine pour prélever chaque section dépliée et laisser sécher les sections pendant au moins une heure.
Lorsque les sections ont séché, étiquetez les lames comme appropriées pour l’expérience et tracez une barrière hydrophobe autour de chaque échantillon. Ensuite, appliquez 1 millilitre de solution de bloc de peroxydase fraîchement préparée sur les sections. Après 30 minutes, retirez la solution de bloc de peroxydase, puis lavez les sections trois fois pendant cinq minutes avec du TBS, puis retirez le TBS et ajoutez une solution bloquant la BSA à 1 % pour une autre incubation de 30 minutes afin de bloquer toute liaison d’anticorps non spécifiques.
À la fin de l’incubation, ajouter l’anticorps primaire d’intérêt, dilué dans du TBS, et couvrir les échantillons pour une incubation d’une nuit à température ambiante. Le lendemain matin, lavez les lames trois fois dans du TBS et appliquez l’anticorps secondaire d’intérêt pendant deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les lames trois fois de plus dans du TBS frais et incuber les échantillons dans une solution complexe de streptavidine-biotine peroxydase fraîchement préparée pendant deux heures à température ambiante, suivie de trois autres lavages de TBS.
Traitez ensuite la vaisselle avec une solution de substrat de peroxydase AEC fraîchement préparée pendant 20 à 30 minutes. Lorsque l'intensité de coloration souhaitée se développe, rincez les lames à l'eau courante du robinet pendant cinq minutes et contre-colorez les sections avec une solution d'hématoxyline filtrée de Mayer. Après deux minutes, lavez les lames à l’eau courante du robinet pendant encore cinq minutes, puis égouttez les lames et couvrez les sections avec un agent de montage aqueux permanent, en séchant les échantillons dans un four de séchage à 80 degrés Celsius.
Une fois refroidis, montez les échantillons avec un support de montage DPX et une lamelle pour leur analyse à un grossissement de 40 fois sur un microscope optique.