Encyclopédie des expériences JoVE
Recherche sur le cancer
0 vues • 5:08 min • April 30th, 2023
- La thérapie photodynamique ou PDT est un type de luminothérapie utilisant des photosensibilisants - des molécules activées par des lumières de longueurs d’onde spécifiques. Un photosensibilisateur excité convertit l’oxygène moléculaire présent dans les cellules en espèces réactives de l’oxygène qui provoquent la mort cellulaire. Pour commencer l’essai, préparez un système d’administration de médicament à base de nanoparticules contenant la concentration appropriée du photosensibilisant, seul ou en combinaison avec un médicament d’essai.
Ajoutez la concentration souhaitée de cette suspension de nanoparticules dans une culture de cellules cancéreuses du poumon. Incuber la culture dans l’obscurité pendant un temps approprié pour faciliter l’absorption cellulaire des nanoparticules. Remplacez la suspension par le milieu de culture souhaité. Par la suite, positionnez un laser à fibre de thérapie photodynamique au-dessus de la culture à une distance optimale facilitant un éclairage uniforme. Irradiez les cellules à une longueur d’onde appropriée pour le temps souhaité et incubez pendant la nuit.
Remplacez le milieu par une solution de mesure de cytotoxicité appropriée. Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer la viabilité cellulaire et quantifier les effets cytotoxiques du traitement expérimental. Les cellules irradiées contenant le photosensibilisateur présentent une viabilité réduite. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une analyse phototoxique in vitro de l’hypocrélline B, un photosensibilisant, et du paclitaxel, un médicament anticancéreux, encapsulé dans des nanoparticules d’acide hyaluronique-céramide dans les cellules cancéreuses du poumon A549.
- Pour commencer, synthétisez l’acide hyaluronique-céramide comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Purifier le produit à l’aide d’une membrane de dialyse de 3,5 kilodaltons et le lyophiliser.
Ensuite, préparez des nanoparticules d’acide hyaluronique-céramide par elles-mêmes, des nanoparticules d’acide hyaluronique-céramide avec le photosensibilisant, et des nanoparticules d’acide hyaluronique-céramide avec un agent anticancéreux et le photosensibilisant.
Ensemencez la lignée cellulaire du cancer du poumon A549 dans les puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits à une densité de 1 fois 10 à la cinquième cellule par puits, et incubez les cellules pendant 24 heures. Le lendemain, retirez le milieu et lavez les cellules avec 1 millilitre de PBS.
Ensuite, dissoudre les nanoparticules préparées dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 2 micromoles par millilitre de photosensibilisant, l’hypocrélline B, par vortex.
Dans quatre puits chacun, ajoutez 1 millilitre de PBS, 1 millilitre de nanoparticules vides d’acide hyaluronique et de céramide, 1 millilitre de nanoparticules contenant le photosensibilisant et 1 millilitre de nanoparticules contenant à la fois le photosensibilisant et le médicament anticancéreux.
Lorsque vous avez terminé, couvrez la plaque et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant quatre heures dans l’obscurité pour permettre l’absorption de nanoparticules dans les cellules. Ensuite, retirez toutes les solutions et lavez les cellules en ajoutant 1 millilitre de PBS froid.
Répétez l’étape de lavage une fois de plus, puis ajoutez un milieu de culture frais. Ensuite, placez la plaque de culture à 24 puits sous une fibre de thérapie photodynamique et positionnez la fibre à 1 centimètre du premier puits.
- La distance entre la fibre de thérapie photodynamique et les cellules a été le facteur critique de cette étude. Il était important de trouver la distance optimale qui puisse couvrir toute la cellule avec la lumière.
- Mettez ensuite des lunettes de sécurité et éteignez les lumières. Illuminez les cellules avec le laser dans l’obscurité pendant 5 à 40 secondes pour activer l’oxygène singulet hautement réactif et d’autres radicaux libres dans les nanoparticules contenant du photosensibilisant.
Après l’exposition à la lumière, incubez les cellules dans l’obscurité pendant 24 heures. Ensuite, aspirez le milieu de culture et lavez les cellules avec 1 millilitre de PBS froid. Répétez l’étape de lavage une fois de plus, puis ajoutez 100 microlitres de média et 10 microlitres de solution de mesure de cytotoxicité dans chaque puits.
Incuber les cellules dans la solution pendant deux heures dans l’obscurité, puis déplacer tous les échantillons dans une plaque de 96 puits. Mesurez l’absorbance à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques.