Isolement des exosomes : une technique pour séparer les exosomes du plasma des patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules
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0 vues • 4:21 min • April 30th, 2023
- Les exosomes sont de petites vésicules membranaires portant des biomolécules telles que des lipides, des protéines, de l’ADN, de l’ARNm et des microARN. Les exosomes sont libérés par différents types de cellules dans les espaces extracellulaires et peuvent être isolés à partir de biofluides comme le plasma.
Pour commencer, centrifugez l’échantillon de plasma pour éliminer les cellules et les débris. Transférez le surnageant plasmatique dans un tube frais. Traitez le plasma avec la concentration souhaitée d’enzyme ribonucléase. Incuber l’échantillon sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant une durée appropriée.
L’enzyme dégrade tout ARN libre dans l’échantillon, tandis que l’ARN exosomal reste protégé. Diluez l’échantillon à l’aide de PBS. Ensuite, ajoutez la concentration souhaitée de solution enzymatique de protéinase K et incubez à 37 degrés Celsius pendant un temps approprié. La protéinase K dégrade la majeure partie des protéines plasmatiques. Il inactive également l’enzyme ribonucléase précédemment ajoutée, éliminant ainsi le risque de dégradation de l’ARN exosomal pendant le traitement en aval.
Ajouter un volume approprié de tampon de précipitation d’exosomes pour faciliter la séparation des exosomes du plasma. Centrifuger l’échantillon pour obtenir une pastille contenant des exosomes intacts. Les exosomes isolés trouvent des applications dans les étapes en aval comme les extractions d’ARN et de protéines.
Dans le protocole suivant, nous effectuerons l’isolement d’exosomes à partir d’un échantillon de plasma de patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules.
- Pour commencer, décongelez un échantillon de plasma de 1 millilitre sur de la glace. Une fois décongelé, retournez le tube plusieurs fois pour désagréger les cryoprécipités qui ont pu se former. Ensuite, centrifugez le plasma à 2 000 G pendant 20 minutes à température ambiante, afin d’éliminer les cellules et les débris. Récupérez le surnageant et centrifugez à nouveau le plasma, maintenant à 10 000 G pendant 20 minutes. Encore une fois, prélevez le surnageant plasmatique et ajoutez maintenant 10 microlitres de RNAse. Incuber le plasma à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un chauffe-bloc thermique.
- Nous avons ajouté une étape de traitement à l’ARNase au protocole standard du kit afin de dégrader les microARN libres. Par la suite, l’étape de traitement à la protéinase K, incluse dans le protocole du kit, a été exploitée afin de dégrader l’ARNASE et de protéger l’intégrité des microARN exosomaux.
- Ensuite, transférez le plasma dans un nouveau tube à un demi-volume de 1x PBS et vortex-le. Ensuite, ajoutez 0,05 volume de solution de protéinase K, vortex à nouveau l’échantillon et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Maintenant, ajoutez 0,2 volume de tampon de précipitation d’exosome et mélangez l’échantillon par inversion. Ensuite, incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.
Après l’incubation à froid, centrifugez l’échantillon à 10 000 G pendant cinq minutes à température ambiante. Prélever une aliquote de 20 à 50 microlitres de surnageant et la stocker à des fins de contrôle. Ensuite, aspirez et jetez le surnageant restant.
Remettre en suspension la pastille d’exosome dans le tampon de votre choix, à un volume dépendant de l’analyse en aval. Pour l’analyse de l’ARN, ajoutez un tampon de lyse spécifique pour l’extraction de l’ARN.
Aperçu
Cet article traite de l'isolement d'exosomes à partir d'échantillons de plasma, spécifiquement de patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules. Les exosomes sont de petites vésicules qui transportent diverses biomolécules et jouent un rôle important dans la communication intercellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Oncologie
Contexte
- Les exosomes sont des vésicules limitées par une membrane libérées par les cellules.
- Ils contiennent des lipides, des protéines, de l'ADN, de l'ARNm et des microARN.
- Les exosomes peuvent être isolés à partir de fluides biologiques tels que le plasma.
- Les techniques d'isolement sont cruciales pour l'étude des contenus exosomaux.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'isolement des exosomes à partir du plasma.
- Approfondir la compréhension de l'intégrité de l'ARN exosomal au cours du traitement.
- Faciliter les applications en aval telles que l'extraction d'ARN et de protéines.
Méthodes utilisées
- Centrifugation du plasma pour éliminer les cellules et les débris.
- Traitement par une ribonucléase pour dégrader l'ARN libre.
- Utilisation de la protéinase K pour protéger l'ARN exosomal.
- Précipitation et isolement des exosomes par centrifugation.
Résultats principaux
- Isolation réussie d'exosomes intacts à partir d'échantillons de plasma.
- Préservation de l'intégrité de l'ARN exosomal pendant le traitement.
- Le protocole permet une analyse en aval efficace.
Conclusions
- Le protocole décrit est efficace pour l'isolement des exosomes.
- Il améliore la fiabilité des études sur l'ARN exosomal.
- Des applications supplémentaires en recherche sur le cancer sont possibles.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement fiable des exosomes à partir du plasma permet un accès non invasif à des biomarqueurs moléculaires, soutenant la détection précoce et le suivi longitudinal en recherche oncologique. Ce protocole améliore la confiance prédictive dans la découverte de biomarqueurs et les études translationnelles en préservant l'intégrité de l'ARN et des protéines exosomales. La méthode établit la biopsie liquide fondée sur les exosomes comme un outil évolutif pour la validation de biomarqueurs à l'échelle du portefeuille et le suivi de l'évolution de la maladie.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de l'ARN et des protéines circulants contenus dans les exosomes pour la validation de cibles.
- Contribue à l'atténuation des risques biologiques en isolant les vésicules pertinentes à la maladie à partir du plasma de patients.
- Facilite la fiabilité prédictive dans l'identification de biomarqueurs pour les pipelines en oncologie.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des préparations standardisées d'exosomes pour des tests moléculaires en aval.
- Garantit la reproductibilité et la cohérence quantitative de l'extraction des ARN et protéines exosomales.
- Prépare des échantillons adaptés au criblage à haut débit de candidats biomarqueurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les stratégies biomarqueurs translationnelles en permettant des prélèvements sériés chez les patients.
- Assure la continuité entre la découverte et la validation préclinique des biomarqueurs dérivés des exosomes.
- Réduit les risques liés au passage des biomarqueurs candidats à l'évaluation clinique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'isolement des exosomes s'intègre à l'interface entre la biologie de la découverte et la recherche translationnelle, en soutenant les flux de travail allant de l'identification précoce des biomarqueurs à la validation préclinique.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les cargaisons exosomales en tant qu'indicateurs de maladies.
- Dépistage : Fournit des échantillons d'exosomes reproductibles pour le développement et la validation de tests.
- Analytique : Permet la mesure quantitative d'ARN et de protéines exosomales pour des études comparatives.
- Recherche translationnelle : Facilite l'association entre les biomarqueurs de biopsie liquide et les modèles de progression des maladies.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un protocole réutilisable d'isolement des exosomes applicable à plusieurs domaines pathologiques et études.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la découverte de biomarqueurs et la validation de cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'isolement des exosomes pour des protocoles reproductibles et évolutifs.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en permettant une analyse robuste et non invasive des biomarqueurs.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des candidats-biomarqueurs pour leur développement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation de plasma et en biologie des exosomes.
- Suppose un accès à un équipement de centrifugation et à une infrastructure d'analyse moléculaire.
- Exige une standardisation interéquipes pour le traitement des échantillons et l'interprétation des données.
- Adaptable à différents volumes de plasma et à divers besoins analytiques en aval.
- Dépend d'un traitement enzymatique minutieux pour préserver l'intégrité de l'ARN exosomal.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026