Préservation des tissus enrobés de paraffine fixée au formol (FFPE) : une méthode pour étudier la morphologie des tissus

- Tout d’abord, placez une tranche de tissu sur un papier filtre imbibé de PBS pour éviter le rétrécissement ou l’enflure des cellules en équilibrant l’osmolarité. Transférez le tissu dans une cassette histo. Fermez et placez la cassette dans une solution de formol neutre et tamponné. Le FBN contient du formaldéhyde qui se lie aux groupes aminés d’acides aminés et empêche la formation d’acide formique qui pigmente le tissu. Laissez la cassette toute la nuit à basse température, ce qui empêche la dégradation des acides nucléiques et fixe les tissus. Déshydratez le tissu avec plusieurs lavages d’alcool.

Placez-le dans de la paraffine liquide et appuyez dessus jusqu'au fond du moule. Retirez le poids et placez le bas de la cassette histo sur le tissu. Versez de la paraffine liquide sur l’ensemble. Laissez la configuration se solidifier sur une plaque froide. La paraffine est insoluble dans l’eau et, après avoir pénétré dans les tissus déshydratés, elle durcit et aide à la section. Transférez le bloc de tissu sur un microtome. Coupez et collectez de fines sections du tissu sur une lame. Si la section est trop épaisse, l’oxygène et les autres nutriments ne peuvent pas se diffuser à travers la tranche, créant ainsi un faux gradient de nécrose. Si la section est trop fine, elle a tendance à s’enrouler. La vidéo du protocole examine l’expression des biomarqueurs et la viabilité cellulaire des tissus FFPE du cancer du poumon.

- Pour commencer à fixer la tranche souhaitée, transférez-la soigneusement à l’aide d’une pince dans une plaque de 10 centimètres contenant un papier filtre imbibé de 2 à 3 millilitres de PBS et laissez-le flotter. Soulevez ensuite le papier filtre à l’aide d’une pince et placez-le dans une cassette histo. Transférez le papier filtre dans une cassette histo. Ajoutez une goutte d’hématoxyline diluée sur la tranche de tissu pour marquer la position de la tranche pour les étapes suivantes. Fermez la cassette et transférez-la dans une solution de formol neutre tamponnée à 4 % et laissez-la reposer toute la nuit à 4 degrés Celsius. Après le lavage et le traitement de la cassette comme décrit dans le protocole, ouvrez la cassette histo et utilisez un scalpel pour soulever avec précaution la tranche fixée du papier filtre. Jetez le papier filtre et transférez la tranche dans un moule contenant de la paraffine liquide.

Utilisez un poids plat pour presser le tissu contre le fond du moule d’enrobage afin d’assurer une section uniforme. Placez la partie inférieure de la cassette histo sur le dessus du moule, ajoutez de la paraffine liquide par-dessus et laissez refroidir le moule sur une plaque froide pendant 30 minutes. Après cela, séparez le moule refroidi du bloc de paraffine. À l’aide d’un microtome, préparez des sections minces de 4 micromètres de blocs de coupe de tissu FFPE. Coupez l’excès de paraffine entourant le tissu. Pour obtenir des sections uniformes dans tout le tissu, ajustez l’angle du bloc de manière à ce que la surface du bloc soit orientée horizontalement par rapport à la lame. À l’aide d’un pinceau fin, prélevez des sections séquentielles de tissu de la tranche de tissu incrustée en paraffine en commençant par la partie supérieure des lames de verre. Continuez à collecter les sections des couches de tissus plus profondes jusqu’au milieu, puis la partie inférieure des lames de verre.

- La collecte de sections de différentes couches de chaque tranche de tissu sur les lames de l’objet est effectuée pour permettre la capture des gradients potentiels induits par la culture dans la viabilité, la migration cellulaire ou l’expression des biomarqueurs.

- Après avoir collecté les sections, poursuivez leur traitement et leur analyse ultérieure comme décrit dans le protocole.