Préservation des tissus enrobés de paraffine fixée au formol (FFPE) : une méthode pour étudier la morphologie des tissus
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0 vues • 4:17 min • April 30th, 2023
- Tout d’abord, placez une tranche de tissu sur un papier filtre imbibé de PBS pour éviter le rétrécissement ou l’enflure des cellules en équilibrant l’osmolarité. Transférez le tissu dans une cassette histo. Fermez et placez la cassette dans une solution de formol neutre et tamponné. Le FBN contient du formaldéhyde qui se lie aux groupes aminés d’acides aminés et empêche la formation d’acide formique qui pigmente le tissu. Laissez la cassette toute la nuit à basse température, ce qui empêche la dégradation des acides nucléiques et fixe les tissus. Déshydratez le tissu avec plusieurs lavages d’alcool.
Placez-le dans de la paraffine liquide et appuyez dessus jusqu'au fond du moule. Retirez le poids et placez le bas de la cassette histo sur le tissu. Versez de la paraffine liquide sur l’ensemble. Laissez la configuration se solidifier sur une plaque froide. La paraffine est insoluble dans l’eau et, après avoir pénétré dans les tissus déshydratés, elle durcit et aide à la section. Transférez le bloc de tissu sur un microtome. Coupez et collectez de fines sections du tissu sur une lame. Si la section est trop épaisse, l’oxygène et les autres nutriments ne peuvent pas se diffuser à travers la tranche, créant ainsi un faux gradient de nécrose. Si la section est trop fine, elle a tendance à s’enrouler. La vidéo du protocole examine l’expression des biomarqueurs et la viabilité cellulaire des tissus FFPE du cancer du poumon.
- Pour commencer à fixer la tranche souhaitée, transférez-la soigneusement à l’aide d’une pince dans une plaque de 10 centimètres contenant un papier filtre imbibé de 2 à 3 millilitres de PBS et laissez-le flotter. Soulevez ensuite le papier filtre à l’aide d’une pince et placez-le dans une cassette histo. Transférez le papier filtre dans une cassette histo. Ajoutez une goutte d’hématoxyline diluée sur la tranche de tissu pour marquer la position de la tranche pour les étapes suivantes. Fermez la cassette et transférez-la dans une solution de formol neutre tamponnée à 4 % et laissez-la reposer toute la nuit à 4 degrés Celsius. Après le lavage et le traitement de la cassette comme décrit dans le protocole, ouvrez la cassette histo et utilisez un scalpel pour soulever avec précaution la tranche fixée du papier filtre. Jetez le papier filtre et transférez la tranche dans un moule contenant de la paraffine liquide.
Utilisez un poids plat pour presser le tissu contre le fond du moule d’enrobage afin d’assurer une section uniforme. Placez la partie inférieure de la cassette histo sur le dessus du moule, ajoutez de la paraffine liquide par-dessus et laissez refroidir le moule sur une plaque froide pendant 30 minutes. Après cela, séparez le moule refroidi du bloc de paraffine. À l’aide d’un microtome, préparez des sections minces de 4 micromètres de blocs de coupe de tissu FFPE. Coupez l’excès de paraffine entourant le tissu. Pour obtenir des sections uniformes dans tout le tissu, ajustez l’angle du bloc de manière à ce que la surface du bloc soit orientée horizontalement par rapport à la lame. À l’aide d’un pinceau fin, prélevez des sections séquentielles de tissu de la tranche de tissu incrustée en paraffine en commençant par la partie supérieure des lames de verre. Continuez à collecter les sections des couches de tissus plus profondes jusqu’au milieu, puis la partie inférieure des lames de verre.
- La collecte de sections de différentes couches de chaque tranche de tissu sur les lames de l’objet est effectuée pour permettre la capture des gradients potentiels induits par la culture dans la viabilité, la migration cellulaire ou l’expression des biomarqueurs.
- Après avoir collecté les sections, poursuivez leur traitement et leur analyse ultérieure comme décrit dans le protocole.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant de préparer des coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) pour analyse. La méthode assure un bon fixage et un sectionnement adéquat afin de préserver l'intégrité du tissu et de faciliter les études d'expression des biomarqueurs.
Composantes principales de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Histologie
- Traitement des tissus
Contexte
- Les échantillons de tissus sont couramment conservés par inclusion en paraffine (FFPE).
- Une fixation adéquate empêche la dégradation des acides nucléiques.
- Épaisseur des coupes est essentielle pour une analyse précise.
- L'expression des biomarqueurs peut être influencée par les méthodes de traitement des tissus.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode fiable pour la préparation de coupes de tissus inclus en paraffine.
- Garantir des conditions optimales pour l'analyse des biomarqueurs.
- Mettre en évidence l'importance de l'épaisseur des sections dans les études histologiques.
Méthodes utilisées
- Fixation de tranches de tissu dans du formol tamponné neutre.
- Inclusion dans de la paraffine liquide pour la sectionnement.
- Utilisation d'un microtome pour couper des sections minces.
- Récupération des sections pour l'analyse de la viabilité et de l'expression des biomarqueurs.
Résultats principaux
- Préservation réussie de la morphologie tissulaire.
- Capacité à analyser l'expression des biomarqueurs à partir d'échantillons FFPE.
- Démonstration des effets de l'épaisseur des coupes sur l'analyse.
- Apercus sur les gradients potentiels induits par la culture dans les échantillons tissulaires.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode robuste pour la préparation des tissus inclus en paraffine.
- Des techniques appropriées améliorent la fiabilité des analyses histologiques.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette méthode pour divers types de tissus.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La préparation de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) permet une préservation fiable de la morphologie tissulaire pour l'analyse de biomarqueurs en aval dans les protocoles d'oncologie et d'histologie. Cette méthode assure un sectionnement constant et une intégrité structurelle, essentiels à un profilage immunohistochimique et moléculaire précis dans les modèles précliniques de cancer. En minimisant les artefacts dus à une fixation ou à un sectionnement inadéquats, l'inclusion FFPE améliore la reproductibilité des données et la fiabilité des études de validation de cibles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à la préservation de l'architecture tissulaire et à la localisation des biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Fournit une approche standardisée pour stabiliser les échantillons tissulaires en vue d'analyses longitudinales.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des sections tissulaires uniformes, adaptées à la coloration immunohistochimique et à l'évaluation quantitative des biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Garantit une épaisseur de section constante, essentielle pour une détection fiable du signal et la standardisation des dosages.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve l'antigénicité et le contexte structural pour l'évaluation de l'expression cible dans des modèles pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Permet la biobanque d'échantillons précliniques en vue d'analyses rétrospectives et de comparaisons entre études.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La préparation des tissus en inclusion paraffinée (FFPE) s'intègre dans le continuum de la découverte en permettant une conservation fiable des échantillons, depuis la caractérisation précoce des modèles jusqu'aux étapes de validation préclinique.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en préservant les relations spatiales des biomarqueurs et des phénotypes cellulaires dans les tranches de tissus.
- Depistage : Fournit des sections reproductibles et fines qui permettent une pénétration uniforme des anticorps et une quantification fiable du signal dans les tests de dépistage.
- Analytique : Produit des sections adaptées à l'analyse d'image quantitative et au profilage multiplexe des biomarqueurs.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité entre les modèles in vitro ou ex vivo et l'analyse de tissus archivés pour la validation de l'expression des cibles.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité de traitement des tissus standardisée et évolutible, applicable à plusieurs projets en oncologie et à divers systèmes modèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance prédictive en réduisant les artefacts morphologiques et en préservant l'intégrité des épitopes pour une quantification précise des biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Renforce la reproductibilité grâce à des paramètres standardisés de fixation, de déshydratation et d'inclusion.
- Valeur stratégique : Réduit le risque biologique dans le choix des cibles en assurant une qualité de données issue des modèles tissulaires précliniques.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la prise de décision ajustée au risque en fournissant des données histologiques fiables pour les critères d'avancement ou d'abandon des cibles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histopathologie pour optimiser les durées de fixation et l'orientation de l'inclusion.
- Dépend de l'accès à des microtomes, des stations d'inclusion en paraffine et des plaques froides pour un sectionnement reproductible.
- Exige des protocoles standardisés entre les équipes afin d'assurer une uniformité de l'épaisseur des coupes et une constance de la coloration.
- Doit tenir compte de la variabilité du type de tissu en ce qui concerne l'infiltration par la paraffine et le comportement au sectionnement.
- Limité par le masquage potentiel des antigènes lors d'un stockage prolongé, nécessitant une validation pour chaque biomarqueur et condition de stockage.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026