L'ADN des isotopes stables de palpage (ADN-SIP)

L'objectif général de cette procédure est de récupérer l'ADN de micro-organismes actifs ayant consommé un substrat de croissance d'intérêt, sans nécessiter de culture en laboratoire. Cela est réalisé en incubant d'abord un échantillon environnemental avec un substrat marqué par un isotope stable, dans des conditions similaires à celles de l'environnement d'origine. La deuxième étape de la procédure consiste à extraire l'ADN total de cet échantillon marqué par l'isotope.

La troisième étape de la procédure consiste à soumettre cet ADN à une ultracentrifugation en gradient de densité dans du chlorure de césium. La dernière étape de la procédure consiste à fractionner le gradient de densité afin d'obtenir l'ADN lourd et l'ADN léger pour une caractérisation moléculaire ultérieure. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui révèlent l'identité des microorganismes actifs mais non cultivés impliqués dans le métabolisme d'un substrat particulier, grâce à diverses techniques moléculaires possibles, notamment le profilage, les puces à ADN, l'hybridation, l'analyse de clones, l'analyse de banques d'ADN et la métagénomique.

Bonjour, je suis Josh Neufeld du Département de biologie de l'Université de Waterloo. Je suis Eric Dunford, étudiant diplômé au laboratoire Newfeld. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de sondage isotopique de l'ADN, ou DNA-SIP, qui est devenue une technique largement utilisée pour relier l'identité de microorganismes inconnus et potentiellement non cultivables à leur capacité à utiliser un substrat de croissance d'intérêt.

Nous utilisons cette procédure dans le laboratoire Newfeld pour étudier le métabolisme des sources de carbone dans divers environnements terrestres et aquatiques. Aujourd'hui, nous allons vous montrer l'application d'un substrat carboné particulier, le glucose 13 C, à un échantillon de sol. Toutefois, nous reconnaissons que depuis que cette méthode a été initialement développée par le groupe de Colin Merle à l'Université de Warwick, les chercheurs ont diversifié le protocole afin de l'appliquer à de nombreux environnements différents, ainsi qu'à divers isotopes marqués tels que l'azote et l'oxygène.

Aujourd'hui, nous allons nous concentrer sur le carbone, mais le protocole lui-même peut être appliqué à différentes conceptions expérimentales. Commençons donc. Avant le début de cette procédure, préparez tous les réactifs d'analyse isotopique stable de l'ADN ou de l'ADN CYP comme décrit dans la partie écrite de ce protocole.

La DNAC commence par l'incubation de l'échantillon. Les conditions d'incubation varient considérablement en fonction de diverses caractéristiques de l'échantillon et du substrat. Une fois que les conditions d'incubation appropriées ont été déterminées empiriquement, ajoutez l'amendement de substrat adéquat à l'échantillon environnemental.

Vous pouvez également choisir d'ajouter des nutriments supplémentaires afin de permettre la croissance microbienne, si ceux-ci sont nécessaires selon les incubations préliminaires. Une fois que l'incubation de l'échantillon a été préparée, boucher et sceller l'échantillon, puis incuber les échantillons environnementaux contenant le substrat marqué. L'exemple présenté implique l'ajout d'une solution de glucose marquée au carbone 13 à un échantillon de sol.

Ensuite, préparez une incubation témoin afin de servir de comparaison pour confirmer l'étiquetage apparent des acides nucléiques observé lors des étapes suivantes. Préparez cet échantillon dans des conditions identiques, sauf en utilisant du carbone non marqué comme substrat ; capuchonnez, scellez et incubez l'échantillon environnemental avec le substrat non marqué dans les mêmes conditions. Après l'incubation, extrayez l'ADN des microcosmes en utilisant un protocole d'extraction adapté aux applications ultérieures souhaitées. Quantifiez ensuite l'ADN extrait pour les étapes suivantes d'ultracentrifugation à l'aide d'un gel agarose et d'un spectrophotomètre.

Utilisez des rotors verticaux ou presque verticaux pour l'ultracentrifugation afin d'assurer une séparation maximale de l'ADN léger et lourd. Le rotor Beckman Coulter VTI 65.2 possède 16 puits permettant de contenir des tubes en polymère scellables de 5,1 millilitres pour préparer les échantillons en vue de l'ultracentrifugation. Calculez d'abord le volume d'ADN extrait nécessaire pour ajouter entre 0,5 et cinq microgrammes d'ADN dans les tubes d'ultracentrifugation.

À l'aide des concentrations d'ADN déterminées précédemment, déterminez ensuite la densité exacte de la solution mère de chlorure de césium à l'aide d'un réfractomètre numérique. Comme indiqué dans le protocole écrit, calculez le volume de solution d'ADN dans le tampon gradient nécessaire pour obtenir un rapport de mélange approprié.

À l’aide de ces calculs, combiner l’ADN extrait avec le tampon de gradient et 4,8 millilitres de chlorure de césium dans un tube stérile jetable de 15 millilitres. Le volume obtenu sera supérieur à la capacité indiquée des tubes de centrifugation afin de remplir complètement les tubes. Enfin, homogénéiser la solution en retournant le tube 10 fois pour les variantes de ce protocole.

Utilisez un agent de flottaison tel qu'un hydride et du bromure dans la solution de gradient pour permettre la visualisation de l'ADN à l'intérieur du tube. Modifier la densité de l'ADN préparé avec de l'ADN de culture pure, en incluant un gradient de bromure d'AUM comme indiqué ici, est particulièrement utile pour obtenir une confirmation visuelle immédiate de la formation du gradient après chaque centrifugation. Les étapes à suivre lors de l'utilisation d'une telle approche sont décrites dans le protocole écrit.

Pour préparer la première ultracentrifugation, utilisez une poire et une pipette pour remplir soigneusement les tubes d'ultracentrifugation avec les solutions de gradient. Étiquetez les tubes sur l'épaule du tube à l'aide d'un marqueur fin et permanent. Veillez à ce que les tubes soient remplis exactement jusqu'à la base du col, car les tubes insuffisamment remplis ont tendance à éclater pendant l'ultracentrifugation.

Une fois que tous les tubes requis sont remplis avec les solutions échantillons, enregistrez la masse précise de chaque tube, trie les tubes en paires aussi proches que possible et ajoutez ou retirez de nouvelles petites quantités de solution jusqu'à ce qu'ils soient équilibrés à moins de 10 milligrammes près. Maintenez le niveau de la solution aussi proche que possible de la base du tube suivant. Scellez ensuite les tubes à l'aide d'un bouchon de tube conformément aux instructions du fabricant.

Vérifiez que les tubes sont correctement scellés en les retournant et en appliquant une pression modérée. Pesez à nouveau les tubes pour vous assurer qu'ils sont toujours équilibrés après le scellage, avant l'ultracentrifugation. Inspectez soigneusement chaque alvéole du rotor afin de garantir qu'elle est propre et exempte de poussière ou de débris pouvant percer les tubes pendant l'ultracentrifugation.

Insérez les tubes dans le rotor en plaçant les paires équilibrées l'une en face de l'autre. Notez la position du rotor pour chaque échantillon, car le processus d'ultracentrifugation peut rendre les étiquettes de marquage illisibles. Scellez soigneusement les alvéoles du rotor conformément aux indications du fabricant.

Une fois les puits du rotor scellés, charger le rotor dans l'ultracentrifugeuse. Fermer la porte de l'ultracentrifugeuse et appliquer un vide pour le rotor VTI 65.2. Régler la vitesse de rotation à 44 100 tr/min, la température à 20 degrés Celsius et la durée d'ultracentrifugation à 36 à 40 heures.

Veillez à ce que le vide soit activé, sélectionnez l'accélération maximale et désactivez le frein pour éviter toute perturbation du gradient due à une décélération. Immédiatement après l'ultracentrifugation, retirez délicatement le rotor. Prenez soin de ne pas incliner ni heurter le rotor afin d'éviter de perturber les gradients à l'intérieur des tubes.

Enfin, retirez délicatement les tubes pour la fractionnation par gradient. L'ADN peut être extrait des tubes d'ultracentrifugation en utilisant la technique de fractionnation. Pour commencer, remplissez une seringue stérile de 60 millilitres avec de l'eau distillée et désionisée stérile contenant suffisamment de colorant bleu propofol.

Pour obtenir une couleur bleu foncé, placez la seringue sur le bras de chargement de la pompe à seringue. Ensuite, fixez un tube de pompe équipé d'une aiguille de 23 gauge d'un pouce de longueur et mettez la pompe en marche jusqu'à ce que de l'eau s'écoule par l'extrémité de l'aiguille. Évitez toute bulle d'air dans l'approvisionnement en eau, car elles affecteraient négativement le processus de fractionnement.

Pour chaque échantillon, préparez 12 tubes stériles de microcentrifugation de 1,5 millilitre étiquetés indiquant le numéro de l'échantillon et la fraction. Ensuite, fixez l'un des tubes d'ultracentrifugation à un support avec une pince à l'aide d'un mouvement rapide et contrôlé. Percez le fond du tube le long de la soudure du tube à l'aide d'une aiguille neuve de 23 gauge et de 2,5 cm, puis faites tourner l'aiguille pour vous assurer qu'un trou uniforme a été formé.

Vous pouvez constater que les gants en latex offrent une meilleure adhérence sur la tige de l'aiguille que les gants en nitrile. À l'aide de l'aiguille fixée au tube de la pompe, percer le dessus du tube au niveau de l'épaule supérieure, le long de la soudure, de manière rapide et contrôlée. Notez qu'il est également possible de percer d'abord le dessus du tube, puis le dessous.

Remarquez également qu'une petite quantité d'huile minérale recouvrant l'épaule du tube peut aider à prévenir les fuites dues à un joint imparfait autour de l'aiguille supérieure, même avec un débit de pompe précédemment calibré. Pompez l'eau colorée dans la partie supérieure du tube afin d'obtenir 12 fractions de 425 microlitres en 12 minutes. Utilisez un minuteur pour recueillir la solution en gradient dans des tubes microcentrifugeables préalablement étiquetés.

Enfin, vérifiez la densité de toutes les fractions pour au moins un échantillon ou un gradient témoin. Utilisez un réfractomètre numérique. Attendez-vous à des valeurs comprises entre 1,690 et 1,760 grammes par millilitre, avec une densité médiane d’environ 1,725 grammes par millilitre pour précipiter l’ADN de toutes les fractions.

Tout d'abord, ajoutez 20 microgrammes de polyacrylamide linéaire comme vecteur pour la précipitation et mélangez par retournement. Ajoutez ensuite deux volumes de solution de PEG et mélangez à nouveau par retournement. Laissez les tubes à température ambiante pendant deux heures afin de permettre la précipitation de l'ADN après incubation.

Placer les échantillons dans une microcentrifugeuse avec les tubes orientés dans la même direction afin d'assurer une localisation cohérente du culot après centrifugation. Centrifuger les tubes à 13 000 G pendant 30 minutes, puis retirer les échantillons de la microcentrifugeuse et aspirer soigneusement le surnageant pour le jeter. À cette étape, le culot doit être visible à l’aide d’une source lumineuse intense.

Lavez le culot avec 500 microlitres d'éthanol à 70 % après avoir centrifugé le culot. Centrifugez les échantillons à 13 000 ×g pendant 10 minutes, puis aspirez soigneusement et jetez le surnageant après la centrifugation. Le culot sera désormais plus visible, mais il se détachera plus facilement de la paroi du tube.

Laisser sécher le culot à température ambiante pendant 15 minutes. Une fois les culots secs, resuspendre chaque culot dans 50 microlitres de tampon TE. Enfin, déposer cinq microlitres de chaque fraction sur un gel agarose pour caractériser les fractions du gradient en utilisant les méthodes décrites dans le protocole écrit.

Des résultats typiques de SIP ADN démontreront une séparation de l'ADN marqué et non marqué sous forme de gradient par ultracentrifugation. Idéalement, on observera une résolution complète du matériel génétique de haut poids moléculaire, tel que celui marqué au carbone 13 et à l'azote 15, par rapport au matériel non marqué, en particulier des empreintes spécifiques basées sur la PCR associées aux fractions quatre à huit des échantillons incubés avec des isotopes stables, mais pas au substrat natif. Les témoins incubés fournissent une preuve solide reliant des organismes spécifiques au métabolisme d'un substrat marqué particulier lorsqu'ils sont réalisés à partir de l'ADN de deux cultures pures : la souche de *Methyloccus capsulatus* marquée au carbone 13 et *Syntrophus aciditrophicus* ATCC 1021 non marqué. L'ADN génomique marqué et non marqué se sépare en fractions de gradient respectives ayant des densités différentes.

Dans cet exemple, l'ADN marqué par des isotopes lourds peut être observé dans les fractions quatre à cinq, tandis que l'ADN non marqué se trouve à des concentrations élevées dans les fractions neuf à dix. L'ADN amplifié par PCR provenant des mêmes fractions a été analysé par électrophorèse sur gel dénaturant et en gradient, ou DGGE, produisant des profils de bandes distincts correspondant aux deux organismes inclus dans le gradient. La densité des fractions varie approximativement de 1,580 à 1,759 gramme par millilitre, et elles sont présentées par ordre de densité décroissante de gauche à droite.

En revanche, l'interprétation de la séparation des isotopes et des incubations d'échantillons environnementaux peut être plus difficile. Des sols de toundra provenant de Resolute Bay au Canada ont été incubés avec du glucose marqué au carbone 12 ou au carbone 13 pendant une période de 14 jours à 15 degrés Celsius. Les géloses des fractions d'ADN purifiées issues du gradient ont révélé une traînée d'ADN génomique s'étendant des fractions sept à dix, tant pour les incubations au carbone 12 qu'au carbone 13.

Cependant, lorsque l'électrophorèse en gradient de dénaturation (DGGE) des gènes de l'ARNr 16 S a été utilisée pour déterminer l'enrichissement en carbone 13 de la biomasse provenant de taxons microbiens spécifiques, le sol incubé avec du glucose carbone 12 a produit des profils similaires dans toutes les fractions du gradient, tandis que l'échantillon incubé avec du glucose carbone 13 a généré des empreintes DGGE uniquement associées aux fractions cinq à huit. Les bandes conservées, indiquées par les flèches, représentaient un phylogroupe dominant présent dans toutes les fractions du gradient. Ce phylogroupe se déplace vers les fractions plus denses pour l'ADN obtenu à partir du sol incubé avec du glucose carbone 13. L'identité de ce gène particulier de l'ARNr 16 S peut être déterminée afin de guider des approches ultérieures basées sur la métagénomique ou sur la culture.

Nous venons de vous montrer comment réaliser une expérience de sonde isotopique stable de l'ADN, depuis l'incubation des échantillons jusqu'à l'obtention d'ADN marqué pour une analyse moléculaire. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de bien concevoir votre plan expérimental et de faire attention à ne pas ajouter trop de substrat afin d'éviter de biaiser l'expérience en faveur des organismes à croissance rapide. Vous devez également éviter une incubation prolongée pour empêcher le substrat de se diffuser vers d'autres membres de la communauté par l'intermédiaire du réseau trophique.

Vous souhaitez donc utiliser la quantité exacte de substrat et des durées d'incubation suffisantes pour détecter de faibles quantités d'ADN marqué dans les fractions denses à l'aide d'applications sensibles basées sur la PCR. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.