Name: LADN des isotopes stables de palpage (ADN-SIP) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-02T17:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Découvrez la méthode ADN-SIP pour identifier les microorganismes actifs sans culture en laboratoire. Cette technique utilise des isotopes stables et l'ultracentrifugation en gradient de densité pour caractériser les communautés microbiennes impliquées dans le métabolisme de substrats spécifiques.

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Ce travail a été soutenu par le projet stratégique et subventions à la découverte de JDN en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

<ol><li>Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-specific+clades+of+active+marine+methylotrophs+associated+with+a+phytoplankton+bloom+in+a+temperate+coastal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).</li>
<li>Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+populations+active+in+metabolism+of+C1+compounds+in+the+sediment+of+Lake+Washington%2C+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).</li>
<li>Padmanabhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+of+13C-labelled+substrates+added+to+soil+in+the+field+and+subsequent+16S+rRNA+gene+analysis+of+13C-labelled+soil+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).</li>
<li>Bernard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+identification+of+soil+microbial+populations+actively+assimilating+carbon+from+13C-labelled+wheat+residue+as+estimated+by+DNA-+and+RNA-SIP+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques.</a> Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).</li>
<li>Haichar, elZ. ahar, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cellulolytic+bacteria+in+soil+by+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing.</a> Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).</li>
<li>Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing%3A+Technical+considerations+when+resolving+15N-labelled+RNA+in+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients.</a> J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).</li>
<li>Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+with+15N+achieved+by+disentangling+the+effects+of+genome+G+%2B+C+content+and+isotope+enrichment+on+DNA+density%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).</li>
<li>Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+growing+microorganisms+in+soil+by+stable+isotope+probing+with+H218O%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+the+use+of+stable+isotope+probing+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology.</a> Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).</li>
<li>Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+SYBR+safe+technique+for+the+sensitive+detection+of+DNA+in+cesium+chloride+density+gradients+for+stable+isotope+probing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.</a> J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).</li>
<li>Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+contamination+of+glycogen+used+in+nucleic+acid+precipitation+and+assessment+of+linear+polyacrylamide+as+an+alternative+co-precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant.</a> Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+uncultivated+majority%3A+combining+DNA+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomic+analyses+of+uncultivated+Methylocystis+in+acidic+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands.</a> Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).</li>
<li>Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+methylotrophs+revealed+by+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics.</a> Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).</li>
<li>Kalyuzhnaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metagenomics+targets+specific+functional+types+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2, 233-241 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+SJ+%22Microbiology+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).</li>
<li>Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+eats+what%2C+where+and+when%3F+Isotope-labelling+experiments+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age.</a> ISME J. 1, 103-110 (2007).</li>
<li>Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shortens+the+incubation+time+needed+to+detect+benzoate-utilizing+denitrifying+bacteria+by+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.</li>
</ol>

Une bonne conception des isotopes stables expériences de sondage est d&#39;une importance critique pour l&#39;obtention de l&#39;ADN marqué au-dessus de la communauté de fond non étiquetés. Considérations relatives à l&#39;échantillon des durées d&#39;incubation, les concentrations de substrat, les conditions d&#39;incubation (par exemple, les nutriments, l&#39;humidité du sol), cross-alimentation et de reproduction ont été discutées ailleurs 10,18 et nous recommandons au lecteur de consulter ces publications...

<table><tbody><tr><td>Bromophénol bleu</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de césium</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-500</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, qualité réactif</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>652261</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d'éthidium</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>351285212</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide linéaire</td><td>Réactif</td><td>Applichem</td><td>A6587</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 6000</td><td>Réactif</td><td>VWR international</td><td>CAPX1286L-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42409-0010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2711</td><td></td></tr><tr><td>Perles d'hydroxyde de sodium</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3181</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader</td><td>Équipement</td><td>Clare Chemical</td><td>DR46B</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Équipement</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Équipement</td><td>Fisher Scientific</td><td>361013650</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à perfusion</td><td>Équipement</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>N/A</td><td>Numéro de modèle : BSP&lt;br/&gt;Voir &lt;a href=&quot;http://www.braintreesci.com">www.braintreesci.com&lt;/a&gt; pour les détails de commande.</td></tr><tr><td>Scelleur de tubes</td><td>Équipement</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Équipement</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor d'ultracentrifugeuse</td><td>Équipement</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362754</td><td></td></tr><tr><td>Source de lumière ultraviolette</td><td>Équipement</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0017-09</td><td>Toute source UV convient</td></tr><tr><td>Écran facial pour lumière ultraviolette</td><td>Équipement</td><td>Fisher Scientific</td><td>114051C</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons en caoutchouc butyle, gris</td><td>Matériau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27232</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de centrifugation</td><td>Matériau</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342412</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille hypodermique, calibre 23, longueur 2&amp;#8221;</td><td>Matériau</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microfuge, 1,5 mL</td><td>Matériau</td><td>DiaMed</td><td>AD151-N500</td><td></td></tr><tr><td>Joints centraux ouverts, diamètre 20 mm</td><td>Matériau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27230-U</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur, en verre</td><td>Matériau</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6C</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>Matériau</td><td>DiaMed</td><td>BPS340-1000</td><td>Le numéro de catalogue correspond à des pointes de 200 &amp;#x03BC;l. Des pointes de 10 ou 20 &amp;#x03BC;l peuvent être achetées auprès de la même source</td></tr><tr><td>Tuyau de pompe, alésage 1,5 mm x paroi 1,5 mm</td><td>Matériau</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes à vis, 15 mL</td><td>Matériau</td><td>DiaMed</td><td>AD15MLP-S</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de sérum, volume 125 mL</td><td>Matériau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114014</td><td></td></tr><tr><td>Seringue, 60 mL</td><td>Matériau</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;adn des isotopes stables de palpage (adn-sip)

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

L&#39;ADN des isotopes stables de sondage (DNA-SIP) est une technique puissante pour identifier les microorganismes actifs qui assimilent substrats carbonés particulier et des nutriments dans la biomasse cellulaire. Comme telle, cette technique de culture-indépendante a été une méthode importante pour assigner la fonction métabolique avec les diverses communautés vivant dans un large éventail de milieux terrestres et aquatiques. Suite à l&#39;incubation d&#39;un échantillon de l&#39;environnement avec des isotopes stables des composés marqués, extraits d&#39;acides nucléiques est soumis à une ultracentrifugation en gradient de densité et de fractionnement du gradient subséquente de séparer les acides nucléiques de densités différentes. Purification de l&#39;ADN à partir de chlorure de césium récupère étiquetés et non étiquetés d&#39;ADN pour la caractérisation moléculaire ultérieure (par exemple les empreintes digitales, les puces, les bibliothèques clone, métagénomique). Ce protocole fournit la vidéo JoVE visuelle étape par étape, des explications sur le protocole d&#39;ultracentrifugation en gradient de densité de fractionnement du gradient, et la récupération d&#39;ADN marqué. Le protocole comprend également des échantillons de données SIP et met en évidence d&#39;importants conseils et avertissements qui doivent être considérées pour assurer un succès DNA-SIP analyse.

L&#39;ADN des isotopes stables de sondage est une méthode de culture-indépendante pour identifier et caractériser des communautés actives de microorganismes qui sont capables d&#39;utiliser des substrats spécifiques. L&#39;assimilation de substrat enrichi en isotope lourd conduit à l&#39;incorporation des atomes marqués dans la biomasse microbienne. Ultracentrifugation en gradient de densité récupère l&#39;ADN marqué en aval des analyses moléculaires.

L&#39;ADN des isotopes stables de palpage (ADN-SIP)

Le marquage isotopique stable de l'ADN (DNA-SIP) est une technique puissante permettant d'identifier les micro-organismes actifs qui assimilent des substrats carbonés particuliers et...

L'objectif général de cette procédure est de récupérer l'ADN de micro-organismes actifs ayant consommé un substrat de croissance d'intérêt, sans nécessiter de culture en laboratoire. Cela est réalisé en incubant d'abord un échantillon environnemental avec un substrat marqué par un isotope stable, dans des conditions similaires à celles de l'environnement d'origine. La deuxième étape de la procédure consiste à extraire l'ADN total de cet échantillon marqué par l'isotope.La troisième étape de la procédure consiste à soumettre cet ADN à une ultracentrifugation en gradient de densité dans du chlorure de césium. La dernière étape de la procédure consiste à fractionner le gradient de densité afin d'obtenir l'ADN lourd et l'ADN léger pour une caractérisation moléculaire ultérieure. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui révèlent l'identité des microorganismes actifs mais non cultivés impliqués dans le métabolisme d'un substrat particulier, grâce à diverses techniques moléculaires possibles, notamment le profilage, les puces à ADN, l'hybridation, l'analyse de clones, l'analyse de banques d'ADN et la métagénomique.Bonjour, je suis Josh Neufeld du Département de biologie de

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Identification des bactéries métaboliquement actif dans l&#39;intestin du généraliste<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Par ADN isotopes stables de palpage Utilisation<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

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L’enrichissement et le séquençage de l’ADN naissant associé aux protéines (eSPAN) ont été développés pour détecter l’abondance relative d’une protéine associée à la chromatine sur deux brins d’ADN réplicatifs, révélant ainsi une compréhension moléculaire de la réplication de la chromatine et de ses processus couplés. Ce protocole décrit les procédures eSPAN chez les cellules souches embryonnaires (ES) de levure et de souris.

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Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysées à l'aide des tests d'activité de gel.

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L'ADN des isotopes stables de palpage (ADN-SIP)

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