Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Ce vidéo montre la microdissection de la rétine et de la rétine avec le pigment rétinien, l'épithélium, ou l'ÉPR, attaché, provenant d'embryons de poisson zèbre âgés d'un à trois jours après la fécondation. Toutes les procédures peuvent être réalisées à l’aide de fines pinces et de matériel de laboratoire courant. Sous un microscope stéréo standard pour la dissection rétinienne, la couche unique d’ÉPR est retirée et décollée par une action de brossage et par l’adhérence de l’ÉPR à la surface de la plaque de culture.

Pour la dissection rétinienne avec épithélium pigmentaire rétinien (RPE) attaché, les propriétés adhésives de la plaque de culture sont éliminées par broyage embryonnaire et lavage avant la dissection. Afin de préserver le RPE intact, un soulèvement soigneux de ce tissu permet ensuite de séparer efficacement la choroïde et la sclérotique du RPE attaché à la rétine, suivi de l'ablation du cristallin à l’aide d’une aiguille au tungstène gravée chimiquement. Cette méthode de dissection permet d’obtenir des tissus rétiniens intacts et a été utilisée avec succès pour étudier l’expression tissu-spécifique de l’ARN ainsi que les profils de la rétine et de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson zèbre.

Bonjour, je suis Li Jang du laboratoire du professeur UFE Leon du Département des sciences biologiques de l'Université Purdue. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment disséquer les tissus oculaires embryonnaires du poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le réseau génique qui régule le développement de l'œil.

Commençons donc. Huit. Avant la microdissection, préparez les solutions suivantes : milieu E3 filtré, solution de Ringer stérilisée et hydroxyde de sodium à 5 %.

Ensuite, attaquer chimiquement les aiguilles en tungstène. Placer un petit bécher dans une boîte de Pétri à l’aide d’argile afin de faciliter la manipulation du bécher et d’éviter tout déversement d’hydroxyde de sodium. Fixer un trombone standard sur le côté du bécher.

Verser de l'hydroxyde de sodium normal dans le bécher jusqu'à ce que le trombone touche l'hydroxyde de sodium. Relier l'électrode négative d'une alimentation en courant continu au trombone et l'électrode positive à une extrémité d'un court morceau de fil de tungstène. Enrouler l'autre extrémité du fil de tungstène avec une boule d'argile de quatre millimètres de diamètre et plonger cette extrémité dans la solution d'hydroxyde de sodium.

Augmentez la tension à environ trois volts et plongez le fil vers le haut et vers le bas, à intervalles d'une seconde, dans la solution d'hydroxyde de sodium pendant environ 10 minutes. Le fil de tungstène exposé à l'hydroxyde de sodium deviendra progressivement plus fin ; lorsque la boule d'argile tombera de l'autre côté du fil relié à l'électrode positive, celui-ci aura une forme de pointe fine. Rincez la pointe fine avec une solution de Ringer ou de E3 pour éliminer les dépôts salins, puis fixez l'aiguille à un applicateur en bois à l'aide de ruban adhésif ou d'un porte-aiguille pour faciliter la manipulation afin de préparer les embryons pour la dissection.

Entretenir les poissons adultes super selon les protocoles standard la nuit précédant la reproduction. Séparer les poissons parents par paires dans des aquariums de reproduction statiques à l’aide d’un séparateur. Retirer le séparateur après allumage de la lumière de la pièce le lendemain matin et laisser les parents s’accoupler par intervalles de 10 minutes toutes les demi-heures, en séparant les poissons après chaque accouplement.

Conserver les embryons collectés à partir de chaque croisement dans du milieu E3 séparément à 28 degrés Celsius. Stager les embryons à 10 à 12 heures post-fécondation et restager immédiatement avant la dissection aux points temporels spécifiques. Utiliser des boîtes de culture en polystyrène Falcon de 60 par 15 millimètres pour la dissection.

Une nouvelle plaque inutilisée possède une propriété adhésive intrinsèque pour le tissu de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) pouvant durer environ 20 minutes, ce qui peut faciliter le retrait du RPE lors de dissections rétiniennes. Si l'on souhaite conserver la rétine avec le RPE attaché, cette propriété adhésive peut être neutralisée en broyant complètement deux embryons dans une plaque de culture contenant une solution de Ringer, puis en laissant reposer pendant 30 minutes avant la dissection, suivie d'un lavage abondant avec une solution de Ringer fraîche avant la dissection. Toutes les dissections fines sont réalisées avec un grossissement d'environ cinq à huit fois sur un microscope Olympus SC X 16 équipé d'un objectif de un fois.

À l’aide de pinces de Dumont ou d’une aiguille au tungstène gravée chimiquement, réchauffez le plateau du microscope à 28 degrés Celsius. Pour minimiser l’influence des fluctuations de température au début de la dissection rétinienne, transférez un embryon à un stade de développement précis dans cinq millilitres de solution de Ringer dans une plaque de culture Falcon de 60 par 15 millimètres préparée comme décrit pour la dissection rétinienne sans EPVR, sectionnez la tête et une partie du tronc antérieur à l’aide de l’extrémité pointue des pinces en retirant rapidement le corps du poisson zèbre. Ensuite, épinglez l’extrémité postérieure de la section tête-tronc sur la plaque de culture. À l’aide des pinces auxiliaires, ouvrez la tête du côté dorsal en partant du front antérieur.

Retirer le cerveau de manière à exposer la face médiale des yeux, orientée vers le haut pour les manipulations ultérieures. Pour disséquer la rétine, utiliser l'extrémité de la pince pour brosser délicatement l'épithélium pigmentaire rétinien exposé sur la face médiale de l'œil orientée vers le haut, jusqu'à ce qu'une petite ouverture menant à la rétine soit visible. Poursuivre le brossage et l'action de décollement jusqu'à ce que la face médiale de la rétine soit presque entièrement exposée.

Évitez de griffer ou de percer la rétine exposée lors de la suppression de l'ÉPR latérale sur la rétine de l'œil orienté vers la boîte de culture. Tenez la pince à un angle d'environ 45 degrés par rapport à la surface de la plaque de culture et brossez l'œil avec la pince. Retirez l'ÉPR qui adhère relativement fermement à la ora serrata en épinglant la portion détachée de l'ÉPR sur la plaque de culture pour la dissection.

Ensuite, soulevez délicatement la rétine pour éliminer les résidus de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et retirez le cristallin en utilisant la propriété adhésive de la boîte de culture. Veillez à ne pas endommager les cellules rétiniennes, qui adhèrent également légèrement à la surface de la boîte. Si le cristallin ne se détache pas par roulis, utilisez une aiguille en tungstène gravée en effectuant un mouvement circulaire sur la surface du cristallin.

Pour commencer la dissection rétinienne avec épithélium pigmentaire rétinien (RPE) attaché, utilisez une plaque de culture Falcon de 60 par 15 millimètres préparée comme décrit pour une dissection rétinienne avec RPE attaché. Transférez un embryon à un stade de développement spécifique dans cinq millilitres de solution de Ringer. Sectionnez la tête et une partie du tronc antérieur.

Retirer rapidement le corps du poisson zèbre comme indiqué précédemment. Épingler l'extrémité postérieure de la section tête-tronc sur une plaque de culture. À l'aide de la pince d'assistance, ouvrir la tête du côté dorsal en partant du front antérieur.

Retirer le cerveau de manière à exposer la face médiale des yeux, qui doit être orientée vers le haut. Pour les manipulations ultérieures à l’aide de pinces, soulever délicatement l’œil par le côté postéro-latéral et le rouler vers le côté antérieur. La choroïde et les tissus scléraux situés à l’extérieur de la couche de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) sont relativement solidement attachés à la peau et peuvent être en grande partie détachés en roulant soigneusement l’œil vers le côté antérieur.

Retirer le cristallin à l’aide de l’aiguille en tungstène après avoir exposé la face latérale de l’œil et tant que l’œil est encore attaché à la peau pour la dissection rétinienne. En l’absence de l’épithélium pigmentaire de la rétine (RPE) ou avec un cristallin auquel est attaché le RPE, les échantillons dissectés peuvent être recueillis dans du TRIzol dans un tube microfuge pour ARN en vue d’analyses en aval, telles que la caractérisation de l’ARN.

Une dissection rétinienne réussie sans épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est montrée ici, où l'intégrité rétinienne est préservée, comme en témoigne la surface rétinienne intacte. La coupe histologique correspondante montre également que l'architecture rétinienne est très bien conservée. En particulier, la préservation de la matrice extracellulaire située entre la couche des photorécepteurs et le RPE est exceptionnellement bonne.

Une dissection rétinienne avec couche de RPE attachée réussie est indiquée par une couche de RPE intacte et continue. La coupe histologique correspondante montre que les cellules rétiniennes et les cellules de RPE sont en bon état. L'ARN total extrait des rétines disséquées est de haute qualité.

Ce fait est indiqué par l'électrophérogramme et l'image du gel obtenue à partir de l'analyse sur bioanalyseur. La ligne de base est plate et les pics ribosomiques 18 s et 28 s sont intacts. Le nombre d'intégrité de l'ARN est généralement supérieur à 9,8.

Nous venons de vous montrer les procédures de microdissection pour obtenir la rétine embryonnaire de zebrafish avec et sans EPR. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les étapes les plus critiques de la dissection rétinienne sont le mouvement de brossage effectué par la pointe des pinces et le roulage du tissu. Pour l'élimination des vestiges d'EPR, nous avons constaté que placer les coudes sur un repose-bras réglable de votre chaise pendant la dissection peut considérablement stabiliser les mouvements de la main.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.