Name: Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Apprenez la microdissection de la rétine et de l'épithélium pigmentaire rétinien chez les embryons de zebrafish âgés de un à trois jours post-fécondation. Cette méthode permet d'isoler des tissus intacts pour l'étude de l'expression tissulaire spécifique de l'ARN.

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Ce travail est soutenu par un fonds de démarrage à partir du Département des sciences biologiques à l&#39;Université Purdue.

Partie 1: Préparatifs avant microdissection <ol><li> Solutions <ol class="lalpha"><li> E3 moyenne 4 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2 et 0,33 mM MgSO 4). </li><li> Une solution de Ringer, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM d'HEPES, pH 7,2), stérilisée par filtration. </li><li> NaOH 5N. </li></ol></li><li> Gravure chimique des aiguilles de tungstène <ol class="lalpha"><li> Fixez un petit bécher contenant NaOH 5N sur une boîte de Petri par de l'argile. </li><li> Attacher un trombone sur le côté du vase, afin qu'il entre en contact avec la solution de NaOH. </li><li> Connectez l'électrode négative d'une alimentation DC pour le trombone et l'électrode positive à une extrémité d'une pièce courte (~ 2cm) du fil de tungstène. </li><li> Enveloppez l'autre extrémité du fil de tungstène avec une petite boule d'argile et trempette cette fin dans la solution de NaOH. </li><li> Augmenter la tension à environ 3V et tremper le fil de haut en bas dans la solution de NaOH jusqu'à une vitesse de gravure de bons est atteint. Une aiguille dans une bonne qualité peuvent généralement être gravés en 10 minutes. </li><li> Le fil de tungstène exposée à la solution deviendra progressivement plus minces. Quand la boule d'argile tombe, de l'autre côté du fil qui est encore attaché à l'électrode positive aura une forme aiguille pointue. </li><li> Rincer l'aiguille forte avec une solution de Ringer ou E3 pour enlever les dépôts de sel. </li><li> Fixez l'aiguille à un applicateur en bois par un ruban ou un porte-aiguille pour une manipulation facile. </li></ol></li><li> Les plaques de culture <ol class="lalpha"><li> Le Falcon 60 x 15 mm plaques en polystyrène de culture prêts à l'emploi pour la microdissection de la rétine. </li><li> Pour disséquer RPE-joint la rétine, écraser deux embryons complètement dans une plaque de culture contenant la solution de Ringer pour se débarrasser de l'adhésivité de la surface 30 minutes avant la dissection. Peu avant la dissection, laver abondamment la plaque avec une solution de Ringer fraîches. </li></ol></li><li> Collecte des embryons et de la tenue <ol class="lalpha"><li> Zebrafish adultes sont maintenues comme décrit 4, 5. </li><li> Séparez les poissons d'élevage en cuves parent statiques paires par un diviseur de la nuit avant la reproduction. </li><li> Enlevez le séparateur après la lumière ambiante est activée dans le lendemain matin. Laisser les parents à traverser à intervalles de 10 minutes toutes les demi-heures. Séparez les poissons après chaque passage. </li><li> Maintenir les embryons prélevés sur chaque passage dans le milieu de l'E3 séparément à 28 ° C. </li><li> Embryons au stade de 10 à 12 heures après fécondation (HPF) et aime revenir immédiatement avant la dissection au niveau des points de temps spécifique, selon les critères établis 1, 6. </li></ol></li></ol> Partie 2: Dissection - retrait du cerveau et une exposition oculaire <ul><li> Les procédures décrites dans cette section sont communes pour disséquer la rétine (partie 3A) et RPE-joint la rétine (partie 3B). </li><li> Tous les dissections fines sont effectuées par un bout de la pince Dumont et assistée par une autre paire de pince Dumont pour le positionnement des tissus. Une aiguille de tungstène chimiquement gravé peut être utilisé pour des manipulations fines, si nécessaire. </li><li> Tous les dissections fines sont effectuées à un grossissement de 8x ~ 5 sous un microscope Olympus SZX16 équipé d'un objectif 1X ou équivalent. </li><li> Maintenir les embryons dans le milieu de l'E3 dans une paillasse étuve à 28 ° C à côté de la loupe pour accéder facilement embryons lors de la dissection. </li><li> La platine du microscope est chauffé à 28 ° C par une plaque thermo pour minimiser l'influence de la fluctuation de la température sur l'expression génique. </li></ul><ol><li> Transfert d'un embryon à un stade précis de développement d'une solution de Ringer dans un Falcon 60 X 15 mm plaque de culture préparé comme décrit dans la Partie 1 # 3. </li><li> Couper la tête avec une partie du tronc antérieur rapidement du corps. </li><li> Pin l'extrémité postérieure de ce tissu sur une plaque de culture avec la pince aider. </li><li> Ouvrez la tête sur le côté dorsal de départ du front antérieur. </li><li> Enlever le cerveau de sorte que le côté médial de l'œil est exposé et est orientée vers le haut pour des manipulations supplémentaires. </li></ol> Partie 3A: dissection rétiniennes 1 <ol><li> Préparer l'embryon comme décrit dans la partie 2. </li><li> Brosser soigneusement l'EPR exposé sur la face médiale de la balle des yeux qui est orientée vers le haut par le bout de la pince jusqu'à ce qu'une petite ouverture à la rétine est perçue. </li><li> Poursuivre le brossage et l'épluchage d'action jusqu'à la face médiale de la rétine est presque tous exposés. Évitez de gratter et de poinçonnage de la rétine exposée. </li><li> Pour supprimer l'EPR latérale sur la rétine qui est maintenant tournée vers le bas, approche qui et brosse à un angle de 45 ° environ de la surface de plaque de culture. </li><li> Retirez l'EPR qui est attaché relativement fermement à l'ora serrata en épinglant la partie détachée de l'EPR à la cPlaque ulture pour la dissection, puis soulevez délicatement la rétine. </li><li> Rouler la rétine au fond de la boîte de culture pour nettoyer l'EPR résiduels. <ol class="lalpha"><li> Nous avons remarqué que cette plaque notamment Falcon culture en polystyrène a une adhésion préférentielle des RPE pendant environ 20 minutes une fois l'embryon est écrasé. Cette propriété est utilisée pour l'enlèvement des restes EPR. Cependant, les cellules rétiniennes ne collent à la surface dans une moindre mesure, qui peuvent être inspectés de près à fort grossissement. On doit trouver un équilibre entre l'exhaustivité de l'enlèvement RPE et l'intégrité de la rétine. </li><li> L'objectif adhère souvent à la plaque de culture et se détache de la rétine au cours du laminage. Parfois, il est nécessaire de détacher le cristallin par une aiguille de tungstène gravé avec une action tourbillonnante sur la surface de la lentille. </li></ol></li><li> Ces procédures peuvent réussir à éliminer l'EPR de la rétine sans pour autant compromettre l'intégrité du tissu. Ceci est indiqué par une bonne morphologie générale (figure 1B et B ') et l'histologie (figure 1B "), une flèche, en particulier, la préservation de la matrice extracellulaire entre la couche des photorécepteurs et l'EPR est exceptionnellement bonne (figure 1B."; comparer avec l'histologie de l'embryon entier (figure 1A ")). </li></ol> Partie 3B: RPE-attachée de dissection rétiniennes 3 <ol><li> Préparer l'embryon comme décrit dans la partie 2. </li><li> Pin la tête à la plaque de culture par la pince assistant. Soulevez doucement l'œil du côté latéral postérieur et rouler sur le côté antérieur. <ol class="lalpha"><li> La choroïde présomptifs et le tissu scléral à l'extérieur de la couche RPE sont relativement étroitement attachée à la peau et peut être surtout décollée en roulant les yeux attentivement du côté antérieur. </li></ol></li><li> Retirez la lentille avec une aiguille de tungstène après le côté latéral de l'oeil est exposé et quand l'œil est encore attaché à la peau. </li><li> Ces procédures peuvent réussir à préserver la couche d'EPR entier avec la rétine. Choroïde présomptif et le tissu scléral peut être éliminé en grande partie (figure 1C, C 'et C "). </li></ol> Partie 4: collecte d'échantillons de tissus pour des travaux d'ARN <ol><li> Les échantillons peuvent être disséqués recueillies dans TRIzol dans un tube de micro sans RNase pour la caractérisation aval ARN comme décrit précédemment 1. </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> La figure 1 (A). Latérale et (A ') vue dorsale d'une tête de poisson zèbre larvaire à 52 HPF avant dissection. (A ") La section correspondante histologique de la tête des larves dans (A) et (A ') (B). Latérale et (B') vue dorsale d'une rétine disséqués à 54 HPF. La surface de la rétine est intacte des deux latéraux et des vues dorsale. (B ") La section correspondante histologique de la rétine disséqué en (B) et (B '). La structure de la rétine et le laminage rétine est intacte. En particulier, la matrice extracellulaire, entre la couche des photorécepteurs et l'EPR (A ", flèches) a été bien conservé dans la rétine disséqué (B", flèches). (C) et latérale (C ') vue médiale d'un disséqué RPE-attachée rétine à 52 HPF. EPR couche était intact et continu, qui a également été indiqué par la coupe histologique des tissus disséqués (C "). La zone blanche dans C 'est le nerf optique (flèche). Pour l'histologie, les échantillons de tissus ont été prélevés et fixés dans 4% paraformaldéhyde. Plastic enrobage et de sectionnement de ces échantillons ont été réalisées comme décrit 3. Barre d'échelle = 50 microns.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par les soins des animaux et du Comité de Purdue utilisation.

Microdissection de tissus oculaires poisson zèbre peut effectivement obtenir des rétines intactes et RPE-attachée rétines. Cette aide substantielle des études d&#39;expression se rapportant à un tissu oculaire spécifique (ie la rétine ou RPE). En fait, nous avons utilisé avec succès ces procédures pour obtenir des profils d&#39;expression ARN de la rétine entière 1 et 3 EPR. L&#39;utilité de ces profils est fortement soutenue par notre récente identification des voies et des familles de gènes qui s...

<table><tbody><tr><td>Moteur sans fil pour pilon</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation électrique à courant continu</td><td>Lascar</td><td>PSU130</td><td>Toute alimentation continue conviendrait. La tension spécifique d'une machine différente nécessitera une optimisation supplémentaire.</td></tr><tr><td>Pestle jetable &amp;et microtube de 1,5 mL (sans DNase, sans RNase et sans pyrogène)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>Ils sont utilisés pour la collecte de tissus dans du TRIzol en vue d'une analyse d'expression.</td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°5, embouts : 0,05 x 0,01 mm, inox</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>La dimension de la pointe fine est souhaitable, mais elle n'est pas rigide, car il peut être nécessaire d'affûter la pointe de temps à autre.</td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°5SF, embouts : 0,025 x 0,005 mm, inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>La dimension d'une pointe fine est souhaitable, mais elle n'est pas immuable, car il peut être nécessaire d'affûter la pointe de temps à autre.</td></tr><tr><td>Plaques de culture Falcon en polystyrène, 60 x 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>Ces plaques sont utilisées comme plaques de dissection.</td></tr><tr><td>Olympus SZX16 microscope stéréo</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>Tout microscope stéréoscopique conviendrait. Nous avons utilisé un microscope stéréoscopique Leica dans des études précédentes.&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; sans aucun problème. Nous utilisons également exclusivement l'objectif 1X pour la dissection, même si nous avons un objectif 2X installé. </td></tr><tr><td>Pierre à aiguiser</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>Utilisez ceci pour aiguiser la pointe de la pince si nécessaire</td></tr><tr><td>plaque Thermo</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>Cela permet de maintenir la température du tissu tout au long de la dissection et de minimiser l'influence des fluctuations thermiques sur l'expression génique. Nous plaçons également tout le microscope dans une pièce aux conditions environnementales contrôlées, à 28&amp;#x00B0;C lors de la dissection dans des études antérieures&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; avec un bon taux de réussite.</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>fil de tungstène, diamètre de 0,015 pouce</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur en bois</td><td>Puritan</td><td>807</td><td>Ceci est utilisé pour maintenir l'aiguille de tungstène gravée chimiquement.</td></tr></tbody></table>

microdissection de tissus embryonnaires zebrafish eye

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Le poisson zèbre est un modèle animal populaires pour la recherche sur le développement des yeux en raison de sa rapidité<em&gt; Ex utero</em&gt; Le développement et la fécondité bon. En trois jours après la fécondation (DPF), les larves se montrent de la première réponse visuelle. De nombreux gènes ont été identifiés pour contrôler un développement de l&#39;œil bon, mais nous sommes loin d&#39;une compréhension complète de l&#39;architecture génétique sous-jacente. Whole profilage de l&#39;expression des gènes du génome est un outil utile pour élucider génétique du réseau de réglementation pour le développement des yeux. Cependant, la petite taille de l&#39;œil embryonnaire chez le poisson zèbre, il est difficile d&#39;obtenir des tissus de l&#39;œil intact et pur pour l&#39;analyse de l&#39;expression. Par exemple, la longueur antéro-postérieure de l&#39;oeil entre le jour 2 et 3 est seulement environ 200-300 um, tandis que le diamètre de la lentille est um moins 100. En outre, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) qui sous-tendent la rétine est juste un épithélium simple couche. Alors que les profils d&#39;expression génique peuvent être obtenus à partir de l&#39;embryon entier, ils ne représentent pas exactement l&#39;expression de ces tissus. Par conséquent le tissu pur doit être obtenu pour un profil d&#39;expression génique réussie de développement de l&#39;œil. Pour répondre à cette question, nous avons développé une approche de la rétine intacte et microdissect rétine avec RPE jointe de dpf 1-3, qui couvrent les grandes étapes de la morphogenèse des yeux. Toutes les procédures qui peut être fait avec une pince fine et fournitures de laboratoire générale en vertu de stéréomicroscopes standard. Pour la dissection de la rétine, l&#39;EPR à une seule couche est enlevée et décollée par brossage action et l&#39;adhésion préférentielle des restes EPR à la surface de la plaque de culture pour la dissection. Pour RPE-joint la dissection de la rétine, l&#39;adhésion de l&#39;EPR à la plaque de dissection est retiré avant la dissection de telle sorte que l&#39;EPR peut être complètement conservé avec la rétine. Une action de levage attentive de ce tissu peut séparer efficacement la choroïde et la sclère présomptive. La lentille peut être retirée dans les deux cas par une aiguille de tungstène gravé chimiquement. En bref, notre approche peut obtenir des tissus oculaires intact et a été utilisé avec succès pour étudier les profils expression tissu-spécifique de la rétine de poisson zèbre<sup&gt; 1, 2</sup&gt; Et l&#39;épithélium pigmentaire rétinien<sup&gt; 3</sup&gt;.

Cet article décrit une approche pour le poisson-zèbre microdissect rétines avec et sans l&#39;épithélium pigmentaire rétinien attachés, de un à trois embryons jours post-fécondation.

Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Le poisson-zèbre est un modèle animal courant pour la recherche sur le développement de l'œil en raison de son développement rapide ex utero et de sa bonne fécondité. À 3 jours après...

Ce vidéo montre la microdissection de la rétine et de la rétine avec le pigment rétinien, l'épithélium, ou l'ÉPR, attaché, provenant d'embryons de poisson zèbre âgés d'un à trois jours après la fécondation. Toutes les procédures peuvent être réalisées à l’aide de fines pinces et de matériel de laboratoire courant. Sous un microscope stéréo standard pour la dissection rétinienne, la couche unique d’ÉPR est retirée et décollée par une action de brossage et par l’adhérence de l’ÉPR à la surface de la plaque de culture.Pour la dissection rétinienne avec épithélium pigmentaire rétinien (RPE) attaché, les propriétés adhésives de la plaque de culture sont éliminées par broyage embryonnaire et lavage avant la dissection. Afin de préserver le RPE intact, un soulèvement soigneux de ce tissu permet ensuite de séparer efficacement la choroïde et la sclérotique du RPE attaché à la rétine, suivi de l'ablation du cristallin à l’aide d’une aiguille au tungstène gravée chimiquement. Cette méthode de dissection permet d’obtenir des tissus rétiniens intacts et a été utilisée avec succès pour étudier l’expression tissu-spécifique de l’ARN ainsi que les profils de la rétine et de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson zèbre.Bonjour, je suis Li Jang du laboratoire du professeur UFE Leon du Département des sciences biologiques de l'Université Purdue. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment disséquer les tissus oculaires embryonnaires du poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le réseau génique qui régule le développement de l'œil.Commençons donc. Huit. Avant la microdissection, préparez les solutions suivantes : milieu E3 filtré, solution de Ringer stérilisée et hydroxyde de sodium à 5 %. Ensuite, attaquer chimiquement les aiguilles en tungstène. Placer un petit bécher dans une boîte de Pétri à l’aide d’argile afin de faciliter la manipulation du bécher et d’éviter tout déversement d’hydroxyde de sodium. Fixer un trombone standard sur le côté du bécher.Verser de l'hydroxyde de sodium normal dans le bécher jusqu'à ce que le trombone touche l'hydroxyde de sodium. Relier l'électrode négative d'une alimentation en courant continu au trombone et l'électrode positive à une extrémité d'un court morceau de fil de tungstène. Enrouler l'autre extrémité du fil de tungstène avec une boule d'argile de quatre millimètres de diamètre et plonger cette extrémité dans la solution d'hydroxyde de sodium.Augmentez la tension à environ trois volts et plongez le fil vers le haut et vers le bas, à intervalles d'une seconde, dans la solution d'hydroxyde de sodium pendant environ 10 minutes. Le fil de tungstène exposé à l'hydroxyde de sodium deviendra progressivement plus fin ; lorsque la boule d'argile tombera de l'autre côté du fil relié à l'électrode positive, celui-ci aura une forme de pointe fine. Rincez la pointe fine avec une solution de Ringer ou de E3 pour éliminer les dépôts salins, puis fixez l'aiguille à un applicateur en bois à l'aide de ruban adhésif ou d'un porte-aiguille pour faciliter la manipulation afin de préparer les embryons pour la dissection.Entretenir les poissons adultes super selon les protocoles standard la nuit précédant la reproduction. Séparer les poissons parents par paires dans des aquariums de reproduction statiques à l’aide d’un séparateur. Retirer le séparateur après allumage de la lumière de la pièce le lendemain matin et laisser les parents s’accoupler par intervalles de 10 minutes toutes les demi-heures, en séparant les poissons après chaque accouplement.Conserver les embryons collectés à partir de chaque croisement dans du milieu E3 séparément à 28 degrés Celsius. Stager les embryons à 10 à 12 heures post-fécondation et restager immédiatement avant la dissection aux points temporels spécifiques. Utiliser des boîtes de culture en polystyrène Falcon de 60 par 15 millimètres pour la dissection.Une nouvelle plaque inutilisée possède une propriété adhésive intrinsèque pour le tissu de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) pouvant durer environ 20 minutes, ce qui peut faciliter le retrait du RPE lors de dissections rétiniennes. Si l'on souhaite conserver la rétine avec le RPE attaché, cette propriété adhésive peut être neutralisée en broyant complètement deux embryons dans une plaque de culture contenant une solution de Ringer, puis en laissant reposer pendant 30 minutes avant la dissection, suivie d'un lavage abondant avec une solution de Ringer fraîche avant la dissection. Toutes les dissections fines sont réalisées avec un grossissement d'environ cinq à huit fois sur un microscope Olympus SC X 16 équipé d'un objectif de un fois.À l’aide de pinces de Dumont ou d’une aiguille au tungstène gravée chimiquement, réchauffez le plateau du microscope à 28 degrés Celsius. Pour minimiser l’influence des fluctuations de température au début de la dissection rétinienne, transférez un embryon à un stade de développement précis dans cinq millilitres de solution de Ringer dans une plaque de culture Falcon de 60 par 15 millimètres préparée comme décrit pour la dissection rétinienne sans EPVR, sectionnez la tête et une partie du tronc antérieur à l’aide de l’extrémité pointue des pinces en retirant rapidement le corps du poisson zèbre. Ensuite, épinglez l’extrémité postérieure de la section tête-tronc sur la plaque de culture. À l’aide des pinces auxiliaires, ouvrez la tête du côté dorsal en partant du front antérieur.Retirer le cerveau de manière à exposer la face médiale des yeux, orientée vers le haut pour les manipulations ultérieures. Pour disséquer la rétine, utiliser l'extrémité de la pince pour brosser délicatement l'épithélium pigmentaire rétinien exposé sur la face médiale de l'œil orientée vers le haut, jusqu'à ce qu'une petite ouverture menant à la rétine soit visible. Poursuivre le brossage et l'action de décollement jusqu'à ce que la face médiale de la rétine soit presque entièrement exposée.Évitez de griffer ou de percer la rétine exposée lors de la suppression de l'ÉPR latérale sur la rétine de l'œil orienté vers la boîte de culture. Tenez la pince à un angle d'environ 45 degrés par rapport à la surface de la plaque de culture et brossez l'œil avec la pince. Retirez l'ÉPR qui adhère relativement fermement à la ora serrata en épinglant la portion détachée de l'ÉPR sur la plaque de culture pour la dissection.Ensuite, soulevez délicatement la rétine pour éliminer les résidus de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et retirez le cristallin en utilisant la propriété adhésive de la boîte de culture. Veillez à ne pas endommager les cellules rétiniennes, qui adhèrent également légèrement à la surface de la boîte. Si le cristallin ne se détache pas par roulis, utilisez une aiguille en tungstène gravée en effectuant un mouvement circulaire sur la surface du cristallin.Pour commencer la dissection rétinienne avec épithélium pigmentaire rétinien (RPE) attaché, utilisez une plaque de culture Falcon de 60 par 15 millimètres préparée comme décrit pour une dissection rétinienne avec RPE attaché. Transférez un embryon à un stade de développement spécifique dans cinq millilitres de solution de Ringer. Sectionnez la tête et une partie du tronc antérieur.Retirer rapidement le corps du poisson zèbre comme indiqué précédemment. Épingler l'extrémité postérieure de la section tête-tronc sur une plaque de culture. À l'aide de la pince d'assistance, ouvrir la tête du côté dorsal en partant du front antérieur.Retirer le cerveau de manière à exposer la face médiale des yeux, qui doit être orientée vers le haut. Pour les manipulations ultérieures à l’aide de pinces, soulever délicatement l’œil par le côté postéro-latéral et le rouler vers le côté antérieur. La choroïde et les tissus scléraux situés à l’extérieur de la couche de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) sont relativement solidement attachés à la peau et peuvent être en grande partie détachés en roulant soigneusement l’œil vers le côté antérieur.Retirer le cristallin à l’aide de l’aiguille en tungstène après avoir exposé la face latérale de l’œil et tant que l’œil est encore attaché à la peau pour la dissection rétinienne. En l’absence de l’épithélium pigmentaire de la rétine (RPE) ou avec un cristallin auquel est attaché le RPE, les échantillons dissectés peuvent être recueillis dans du TRIzol dans un tube microfuge pour ARN en vue d’analyses en aval, telles que la caractérisation de l’ARN.Une dissection rétinienne réussie sans épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est montrée ici, où l'intégrité rétinienne est préservée, comme en témoigne la surface rétinienne intacte. La coupe histologique correspondante montre également que l'architecture rétinienne est très bien conservée. En particulier, la préservation de la matrice extracellulaire située entre la couche des photorécepteurs et le RPE est exceptionnellement bonne.Une dissection rétinienne avec couche de RPE attachée réussie est indiquée par une couche de RPE intacte et continue. La coupe histologique correspondante montre que les cellules rétiniennes et les cellules de RPE sont en bon état. L'ARN total extrait des rétines disséquées est de haute qualité.Ce fait est indiqué par l'électrophérogramme et l'image du gel obtenue à partir de l'analyse sur bioanalyseur. La ligne de base est plate et les pics ribosomiques 18 s et 28 s sont intacts. Le nombre d'intégrité de l'ARN est généralement supérieur à 9,8.Nous venons de vous montrer les procédures de microdissection pour obtenir la rétine embryonnaire de zebrafish avec et sans EPR. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les étapes les plus critiques de la dissection rétinienne sont le mouvement de brossage effectué par la pointe des pinces et le roulage du tissu. Pour l'élimination des vestiges d'EPR, nous avons constaté que placer les coudes sur un repose-bras réglable de votre chaise pendant la dissection peut considérablement stabiliser les mouvements de la main.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Objectif de développement implique des interactions avec d'autres tissus. Plusieurs mutants oeil de poisson zèbre sont caractérisés par une taille anormalement petite lentille. Ici nous démontrons une expérience de transplantation objectif pour déterminer si ce phénotype est dû à des causes intrinsèques ou des interactions défectueuses avec les tissus qui entourent la lentille.

Objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans l&#39;analyse de mutants Eye

Cette vidéo décrit le protocole qui est développé pour disséquer les lentilles de poisson-zèbre adultes et larvaires afin d’analyser la morphologie du cristallin cortical et l’intégrité structurelle des sutures du cristallin.

Dissection du cristallin : une technique pour observer la morphologie du cristallin du poisson-zèbre

Imagerie du développement vasculaire cérébral chez le poisson zèbre larvaire est décrite. Techniques pour faciliter l'imagerie 3D et modifier le développement vasculaire cérébral en utilisant des traitements chimiques sont également fournis.

Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière est un excellent outil pour l’imagerie du développement embryonnaire. Il permet d’enregistrer de longs films en accéléré d’embryons vivants dans des conditions physiologiques proches. Nous démontrons son application pour l’imagerie du développement de l’œil du poisson-zèbre à de larges échelles spatio-temporelles et présentons un pipeline pour la fusion et la déconvolution d’ensembles de données multivues.

Utilisation de feuilles Lumière Fluorescence Microscopy à l&#39;image du développement Zebrafish Eye

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour obtenir des résultats localisation subcellulaire de protéine sur la rétine de poisson-zèbre en corrélant la microscopie photonique Super-résolution et images de microscopie électronique à balayage.

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

Ici, nous discutons d’une méthode de protocole qui permettra une analyse simple du système vasculaire rétinienne tg(fli:EGFP) adult poisson zèbre comme une lecture rapide en paramètres de pathologies vasculaires à long terme, liées à la néoangiogenèse et changements structurels.

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.

Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Ici, un protocole est fourni pour l’imagerie time-lapse de la morphogenèse oculaire à l’aide d’un microscope à feuille de lumière disponible dans le commerce et d’un poste de travail de traitement d’images pour analyser les données résultantes. Ce protocole détaille les procédures d’anesthésie embryonnaire, l’intégration dans l’agarose à basse température de fusion, la suspension dans la chambre d’imagerie, la mise en place des paramètres d’imagerie et enfin l’analyse des données d’imagerie à...

Visualisation de la morphogenèse oculaire par microscopie Lightsheet à l’aide de rx3:GFP Transgenic Zebrafish

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

Apprenez la microdissection de la rétine et de l'épithélium pigmentaire rétinien chez les embryons de zebrafish âgés de un à trois jours post-fécondation. Cette méthode permet d'isoler des tissus intacts pour l'étude de l'expression tissulaire spécifique de l'ARN.

Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

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