Électroporation organoïde : une méthode pour transfecter l’ADN plasmidique dans des organoïdes gastro-intestinaux

- Les organoïdes sont de minuscules cultures cellulaires tridimensionnelles dérivées de cellules souches spécifiques aux tissus. Ils sont génomiquement stables mais génétiquement modifiables par transfection et donc idéaux pour l’investigation génétique. Pour la transfection, semez les organoïdes dans une plaque de culture multipuits avec un milieu de culture spécifique et incubez pendant la durée souhaitée. Ensuite, ajoutez un mélange de dissociation à la plaque pour aider à la dissociation des cellules organoïdes. Transférez le mélange dans un tube et centrifugez. Remettre en suspension la pastille organoïde dans un tampon d’électroporation contenant de l’ADN plasmidique marqué par fluorescence. Le tampon stabilise les cellules et empêche la mort cellulaire due au stress électrique.

Transférez le mélange dans une cuvette et électroporatez les cellules. Les impulsions électriques à travers la membrane cellulaire entraînent la formation temporaire de pores pour faciliter l’absorption de l’ADN plasmidique dans la cellule. Après l’électroporation, ajoutez immédiatement le milieu de culture à la suspension cellulaire et transférez le mélange dans un tube. Maintenant, centrifugez les cellules. Remettez la pastille en suspension dans la matrice du socle et transférez-la sur la plaque multipuits pour la polymérisation. Placez la plaque sous un microscope fluorescent et vérifiez la fluorescence dans les cellules, ce qui confirme l’efficacité de la transfection. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une électroporation pour transfecter les organoïdes gastro-intestinaux.

- Commencez par préchauffer des plaques de 48 puits à 37 degrés Celsius pour l’ensemencement post-électroporation, puis préparez des milieux basaux et organoïdes spécifiques à la culture selon les instructions du manuscrit. Cultivez cinq puits d’organoïdes par échantillon d’électroporation dans une plaque de 48 puits. Préparez 230 microlitres de réactif de dissociation avec 10 micromolaires de Y27632 par puits. Surveiller les organoïdes au microscope. Retirer le milieu de culture des puits et dissocier mécaniquement les organoïdes dans le mélange de dissociation préparé. Regroupez cinq puits par échantillon d’électroporation dans un tube de 15 millilitres.

Mélangez le contenu du tube par vortex et incubez-le pendant 5 à 15 minutes à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que des grappes de 10 à 15 cellules se produisent, en vérifiant la dissociation au microscope. Arrêtez la digestion en ajoutant jusqu’à 10 millilitres de milieu de base sans antibiotiques. Centrifugez le tube à 450 fois g pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et lavez les cellules deux fois avec 4 millilitres de tampon d’électroporation. Centrifugez et jetez le surnageant après chaque lavage. Après les lavages, remettre en suspension la pastille organoïde dans 100 microlitres de tampon d’électroporation avec 30 microgrammes d’ADN plasmidique.

Versez le mélange complet d’ADN et d’organoïdes dans une cuvette d’électroporation. Assurez-vous d’éviter les bulles d’air. Réglez les paramètres d’électroporation comme décrit dans le manuscrit de texte et tapotez la cuvette avec un doigt pour mélanger doucement les cellules. Placez la cuvette dans la chambre de la cuvette et appuyez sur le bouton d’impédance de l’électroporateur pour noter la valeur d’impédance. Appuyez sur le bouton Start pour lancer le programme d’électroporation et contrôler les valeurs des courants, des tensions et des énergies affichés.

Après l’électroporation, ajoutez immédiatement 500 microlitres de milieu de culture sans antibiotiques aux cellules et mélangez en pipetant de haut en bas. Transférez l’échantillon dans un nouveau tube de 15 millilitres et rincez la cuvette avec un milieu basal pour recueillir les cellules restantes, puis incubez les cellules à température ambiante pendant 40 minutes. Centrifugez les cellules à 450 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de matrice de socle et ensemencez des gouttes de 20 microlitres dans une plaque préchauffée à 48 puits.

Incuber la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius pour la polymérisation et ajouter 250 microlitres de milieu de culture complété par Y27632 et CHIR-99021 par puits. Pour déterminer l’efficacité de la transfection, vérifiez la fluorescence dans le contrôle de transfection au microscope après 24 à 48 heures.