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0 vues • 5:00 min • April 30th, 2023
- Les lymphocytes T activés se déplacent vers le microenvironnement tumoral pancréatique, où ils libèrent des cytokines comme l’interféron-gamma, ou IFN gamma, et le facteur de nécrose tumorale alpha, ou TNF alpha, qui aide à médier une réponse antitumorale efficace. Comme les cytokines sortent rapidement des lymphocytes T, les niveaux intracellulaires peuvent être indétectables. Par conséquent, les lymphocytes T ont besoin d’être stimulés pour augmenter la production de cytokines basales afin d’étudier leur rôle thérapeutique dans la tumeur.
Commencez par prélever une suspension de cellules tumorales du pancréas de la souris. Maintenant, traitez les cellules T présentes dans la suspension cellulaire avec un cocktail de stimulation des cytokines et incubez le mélange pendant la durée souhaitée. Ce cocktail facilite la libération d’ions calcium du réticulum endoplasmique vers le cytoplasme. Des niveaux élevés de calcium, à leur tour, activent certains facteurs de transcription nucléaire, entraînant une augmentation de la production de cytokines dans les lymphocytes T.
Ensuite, traitez les cellules avec un cocktail d’inhibiteurs de transport de protéines et incubez le tube. Ce cocktail bloque le transport des cytokines du réticulum endoplasmique vers le complexe de Golgi, ce qui entraîne l’accumulation de cytokines dans la cellule. Enfin, colorez les cellules à l’aide de marqueurs intracellulaires appropriés pour l’analyse par cytométrie en flux. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une stimulation des lymphocytes T pour augmenter la concentration intracellulaire des cytokines.
- Pour commencer, utilisez une pince pour transférer la tumeur sur une boîte de Pétri. Conservez 5 millilitres de milieu de digestion dans un tube de 50 millilitres sur de la glace pour éviter le début de l’activité enzymatique. Prenez une petite aliquote de cette solution pour couvrir la tumeur sur la boîte de Pétri. À l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince, vous pourrez couper la tumeur en petits morceaux, d’environ moins de 3 millimètres de longueur. Grattez les morceaux de tumeur dans le tube et retournez doucement le tube jusqu’à ce que tous les morceaux soient immergés dans le milieu de digestion. Transférez le tube sur un appareil à agiter pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour digérer. Assurez-vous que tous les morceaux de tumeur sont immergés et ne sont pas collés au bord du tube.
Immédiatement après l’étape de digestion, placez le tube sur de la glace pour ralentir l’activité enzymatique. Ajoutez de l’EDTA pour obtenir une concentration finale de 20 millimolaires et vortex brièvement l’échantillon à mélanger afin de ralentir davantage l’activité enzymatique. Ouvrez le tube et rincez toute digestion tumorale du couvercle du tube avec un milieu RPMI frais. Ensuite, préparez une passoire de 70 microns. Placez-le sur un tube ouvert de 50 millilitres sur de la glace. Pré-mouillez le filtre avec du fluide. Remettez en suspension les cellules digérées et lavez les côtés du tube à l’aide d’une bande de 25 millilitres ou plus. L’ouverture plus large de la bande permet à la digestion épaisse de passer facilement.
Transférez toute la digestion sur la passoire à l’aide de la bande de 25 millilitres. Écrasez de haut en bas la tumeur sur le dessus du filtre à l’aide d’un piston de seringue de 1 millilitre. Laver continuellement les cellules à travers la crépine avec RPMI. Assurez-vous de laver avec suffisamment de force pour pousser les cellules à travers. Continuez à laver jusqu’à ce que toutes les cellules soient passées à travers la passoire. Centrifugez le tube pendant cinq minutes à 300 fois g et 4 degrés Celsius.
Remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire et le RPMI complet, puis passez directement à travers un autre filtre pour éliminer toute matrice extracellulaire ou gros amas de cellules qui ne peuvent pas être remis en suspension de manière adéquate. Si aucune stimulation n’est nécessaire, colorez immédiatement les cellules isolées pour l’analyse par cytométrie en flux ou mettez-les en suspension dans un milieu de congélation à 10 % de DMSO dans FBS et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.
Pour effectuer une stimulation, comptez d’abord les cellules. Diluez les cellules dans un milieu complet pour obtenir une concentration de 2 fois 10 à 6 pour 100 microlitres. Plaque de 100 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à fond en U de 96 puits. Ajouter 100 microlitres de milieu complet contenant une préparation 2X de PMA et d’ionomycine. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’une préparation 10X de Brefeldin-A et de Monensin et un milieu complet pour obtenir une concentration finale de 1,06 micromolaire et 2,0 micromolaires, respectivement. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant encore quatre heures.