Imagerie de la dynamique calcique dans les cellules pancréatiques : une technique pour étudier les changements en temps réel de la concentration de calcium cytosolique dans les îlots pancréatiques
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0 vues • 5:10 min • April 30th, 2023
- Les îlots pancréatiques sont un amas de cellules pancréatiques productrices d’hormones qui jouent un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie du glucose. Une concentration élevée de glucose déclenche la fermeture des canaux ioniques potassiques, empêchant l’efflux d’ions potassiques, entraînant une dépolarisation membranaire. En conséquence, des canaux d’ions calcium voltage-dépendants s’ouvrent, permettant l’afflux d’ions calcium. Cette concentration accrue de calcium cytosolique stimule la libération d’hormones comme l’insuline. En temps réel, pour imager la dynamique cytosolique du calcium, transférez quelques îlots chargés d’un colorant indicateur de calcium approprié entre les parois d’espacement d’un maillage fin préassemblé.
Positionnez le treillis à l’envers sur une lamelle placée à l’intérieur de la chambre d’imagerie d’un microscope inversé. Placez un maillage grossier et un poids pour immobiliser les cellules. Ajoutez la solution d’imagerie dans la chambre. Ensuite, mettez en place un système de perfusion pour introduire du glucose ou une hormone de test d’intérêt. À l’intérieur des cellules, des indicateurs de calcium fluorescents préchargés signalent toute augmentation des concentrations de calcium cytosolique. Lors de la liaison aux ions calcium, les molécules indicatrices présentent une augmentation substantielle de l’émission de fluorescence. Dans le protocole suivant, nous montrerons l’imagerie en temps réel de la dynamique du calcium dans les îlots pancréatiques murins en réponse à la perfusion de glucose.
- Pour immobiliser les îlots pour l’imagerie, assemblez une chambre d’imagerie pour un microscope inversé et placez une lamelle en verre à l’intérieur de la chambre. Assurez-vous que l’interface de la chambre en verre est étanche et vérifiez que la lamelle est à portée de l’objectif du microscope. Ensuite, coupez des carrés de 20 X 20 millimètres de mailles fines et grossières et utilisez des morceaux de 45 à 50 micromètres de ruban adhésif épais pour créer deux parois d’espacement sur un morceau de maille fine. Plongez la maille grossière et un poids dans une boîte de Pétri de 35 millimètres de solution d’imagerie et placez la maille fine sous un microscope de dissection.
Retournez le grillage fin avec les parois de l’entretoise et les entretoises vers le haut et utilisez une pipette P20 pour transférer plusieurs îlots entre les deux entretoises. À l'aide d'une pince d'horloger, placez le treillis à l'envers à l'intérieur de la chambre d'imagerie du microscope inversé de sorte que les entretoises soient orientées vers le bas pour reposer directement sur la lamelle de la chambre, en piégeant les îlots entre les entretoises et le treillis au milieu de la lamelle.
- Veillez à ce que le treillis soit bien hydraté sans contenir des volumes excessifs de solution, ce qui provoquerait le mouvement latéral de l’échantillon.
- Ensuite, placez le maillage grossier et le poids sur le maillage fin dans la chambre et ajoutez une solution d’imagerie dans la chambre. Une fois les îlots immobilisés, sélectionnez le mode d’imagerie et l’objectif sur le microscope inversé et placez la chambre avec les îlots sur la platine à température contrôlée du microscope. Après avoir réglé la périfusion, positionnez l’entrée plus bas que l’écoulement sortant dans la chambre et réglez le flux sortant pour qu’il soit supérieur au flux entrant.
Assurez-vous que l’écoulement a un contact minimal avec la solution afin qu’il élimine la solution en plusieurs petites gouttelettes séquentielles d’attente, de longs intervalles d’élimination continue de la solution. Ensuite, lancez la périfusion avec une solution d’imagerie contenant 3 millimolaires de glucose et sélectionnez le trajet lumineux et les filtres pour l’imagerie des fluorophores verts. Ensuite, exécutez l’imagerie en direct pour configurer les paramètres d’imagerie et ajustez la vue pour capturer les îlots de mer qui vous intéressent.
Pour optimiser le rapport signal/bruit de l’image, ajustez l’intensité de la lumière d’excitation, le temps d’exposition et le binning, en veillant à ce que les paramètres permettent une visualisation distincte de chaque cellule à l’intérieur des îlots avec l’intensité lumineuse et l’exposition minimales possibles. Ensuite, imagez les îlots à 0,1 à 5 Hertz, en vérifiant la qualité des données acquises au fur et à mesure de leur capture.
Aperçu
Cet article décrit un protocole d'imagerie en temps réel des dynamiques calciques cytosoliques dans les îlots pancréatiques de souris en réponse à une perfusion de glucose. La méthode consiste à immobiliser les îlots et à utiliser des indicateurs fluorescents du calcium afin de visualiser les variations de concentration en calcium.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Endocrinologie
Contexte
- Les îlots pancréatiques jouent un rôle essentiel dans l'homéostasie du glucose.
- L'entrée d'ions calcium est indispensable à la libération d'hormones, en particulier de l'insuline.
- Les techniques d'imagerie en temps réel permettent de comprendre les dynamiques calciques dans les îlots.
- Les indicateurs fluorescents offrent une méthode pour visualiser les variations du calcium.
Objectif de l'étude
- Démontrer un protocole d'imagerie des dynamiques calciques dans les îlots pancréatiques.
- Comprendre la réponse des îlots à la perfusion en glucose.
- Optimiser les paramètres d'imagerie pour une meilleure visualisation des réponses cellulaires.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une chambre d'imagerie pour un microscope inversé.
- Utilisation d'une maille fine et d'une maille grossière pour immobiliser les îlots pancréatiques.
- Application d'indicateurs fluorescents du calcium pour détecter les niveaux de calcium.
- Configuration d'une imagerie en temps réel avec une perfusion contrôlée de solution de glucose.
Résultats principaux
- Immobilisation réussie des îlots pour l'imagerie.
- Visualisation en temps réel des dynamiques calciques en réponse au glucose.
- L'optimisation des paramètres d'imagerie a amélioré la clarté du signal.
- Les indicateurs fluorescents ont efficacement rapporté les variations de concentration en calcium.
Conclusions
- Le protocole permet une étude détaillée de la dynamique calcique dans les îlots pancréatiques.
- L'imagerie en temps réel peut améliorer la compréhension de la libération hormonale induite par le glucose.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette méthode pour explorer d'autres réponses hormonales.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie en temps réel des dynamiques calciques cytosoliques dans les sous-populations d'îlots pancréatiques permet une interrogation précise des mécanismes de sécrétion hormonale, essentiels à la recherche sur les maladies métaboliques. Cette technique renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles et la réduction fonctionnelle des risques au stade précoce de la découverte, notamment pour les programmes sur le diabète et les troubles métaboliques. Ses résultats quantitatifs facilitent une intégration robuste des données entre fonctions et orientent les décisions d'avancement ajustées au risque.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet la validation fonctionnelle de sous-populations de cellules des îlots en réponse à des stimuli glucidiques et hormonaux.
- Contribue à l'analyse mécanistique des risques en visualisant directement les voies sécrétoires médiées par le calcium.
- Fournit des données quantitatives en temps réel permettant de clarifier l'interaction avec la cible et la modulation de la voie.
- Facilite le tri des cibles candidates en fonction des réponses cellulaires dynamiques.
Développement de criblages et de tests
- Établit des flux de travail d'imagerie validés et reproductibles pour le criblage de composés en aval.
- Fournit des mesures quantitatives de fluorescence pour la standardisation et la reproductibilité des tests.
- Permet une évaluation fiable des effets des composés sur la signalisation calcique dans les cellules des îlots.
- Facilite la réutilisation de la plateforme pour diverses études sur les hormones et les voies métaboliques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les dynamiques calciques in vitro avec la fonction des îlots pertinente pour la maladie, assurant une continuité translationnelle.
- Offre des éclairages mécanistiques permettant d'orienter le choix des modèles précliniques et les stratégies de biomarqueurs.
- Réduit l'ambiguïté biologique dans le développement de programmes contre les maladies métaboliques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette technique d'imagerie s'intègre à l'interface entre la phase initiale de découverte et l'identification de composés candidats, soutenant à la fois la validation ciblée guidée par une hypothèse et le développement de tests pour la recherche sur les maladies métaboliques.
- Biologie de la découverte : L'imagerie quantitative du flux de calcium permet de clarifier la signalisation des cellules des îlots et l'engagement fonctionnel des cibles.
- Tri : Des signaux fluorescents standardisés permettent une évaluation reproductible des composés entre les expériences.
- Analytique : La mesure en temps réel du calcium cytosolique fournit des données exploitables pour la comparaison des conditions et l'analyse statistique.
- Recherche translationnelle : Facilite la concordance entre les résultats in vitro et les modèles précliniques de maladies lors de l'étude de la fonction des îlots.
- Réutilisation en entreprise : Le protocole est adaptable à l'étude de multiples hormones et voies métaboliques au sein des équipes de recherche et développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique en biologie des îlots.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles d'imagerie standardisés et reproductibles, adaptés à une utilisation à grande échelle et à une adoption interéquipes.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et améliore l'efficacité du capital en clarifiant les risques biologiques précoces.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles et programmes visant les maladies métaboliques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie de cellules vivantes et en microscopie à fluorescence.
- Exige un accès à des microscopes inversés, à des systèmes de perfusion et à des logiciels analytiques pour l'analyse quantitative.
- Implique une standardisation inter-équipes des paramètres d'imagerie et de l'interprétation des données.
- Adaptable à diverses sous-populations d'îlots et à différents stimuli hormonaux moyennant une optimisation du protocole.
- L'immobilisation de l'échantillon et l'optimisation du signal sont essentielles pour minimiser les artefacts et garantir la qualité des données.
F.A.Q. sur la bioindustrie pharmaceutique
Imagerie Ca
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Dernière mise à jour : 22 août 2026