Isolement de cellules acineuses primaires : une méthode pour isoler des cellules acineuses du pancréas de souris

- Une cellule acineuse pancréatique est une cellule exocrine qui contient une variété d’enzymes digestives. Parfois, en réponse à la signalisation oncogène, la cellule acineuse se transforme en cellule canalaire. Cette cellule canalaire peut devenir cancéreuse plus tard. Par conséquent, il est essentiel d'isoler les cellules acineuses pour étudier leur rôle dans la progression du cancer du pancréas.

Commencez par isoler le pancréas d’une souris euthanasiée. Ajoutez le pancréas dans un bateau de pesée contenant une solution saline équilibrée complétée par un antibiotique. Coupez le pancréas en petits morceaux à l’aide de ciseaux et ajoutez le tissu pancréatique dans un tube. Ensuite, ajoutez la solution de collagénase aux morceaux de pancréas dans le tube.

La collagénase digère le collagène qui maintient le tissu ensemble de sorte que le tissu se brise en petits morceaux. Maintenant, ajoutez un milieu contenant du sérum dans le tube et placez le tissu sur de la glace. Cela aide à arrêter l’action de la collagénase.

Filtrez deux fois le tissu et le média, en diminuant progressivement la taille des mailles du filtre à chaque fois pour obtenir une suspension fine des tissus. Enfin, centrifugez la suspension résultante pour recueillir les cellules acineuses dans la pastille. Retirez le surnageant et conservez les cellules acineuses pour une analyse plus approfondie. Dans le protocole suivant, nous isolerons des cellules acineuses du pancréas d’une souris euthanasiée.

- Pour disséquer le pancréas d’une souris euthanasiée, épinglez d’abord les pattes de la souris sur le couvercle en polystyrène, en l’orientant de manière à ce que la queue soit face au chercheur, et vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez une pince autoclave pour soulever la fourrure et la peau sur la ligne médiane, et avec des ciseaux autoclavés, faites une incision à travers la fourrure et la peau de l’ouverture urétrale à la zone du diaphragme et de la cage thoracique. Faites des incisions supplémentaires à gauche et à droite pour couper la fourrure et la peau, créant ainsi une vue claire de la cavité abdominale.

Ensuite, coupez la muqueuse péritonéale au milieu et à droite et à gauche, et retirez-la des organes. Utilisez la pince pour soulever les intestins et déplacez-les vers le côté gauche de la souris, créant ainsi un espace pour voir le pancréas rose clair attaché à la rate ovale rouge foncé. Le tissu pancréatique aura une texture molle et spongieuse. Découpez le pancréas, qui longe l’estomac, en s’entrelaçant avec les intestins.

Séparez la rate du pancréas et placez le pancréas dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS avec 1X pénicilline-streptomycine et transférez-le dans la hotte à flux laminaire. Versez le contenu du tube dans un bateau de pesée vide et utilisez une pince pour laver le pancréas en le faisant tourner. Ensuite, à l’aide de la pince, déplacez le pancréas vers un deuxième bateau de pesée contenant du HBSS avec de la pénicilline-streptomycine et lavez-le à nouveau en remuant.

Déplacez le pancréas vers le troisième bateau de pesée contenant HBSS avec pénicilline-streptomycine et commencez à couper le pancréas en morceaux de 5 millimètres ou moins. Pour verser le contenu du bateau de pesée dans un tube frais de 50 millilitres, utilisez d’abord la pince pour déplacer les morceaux de pancréas dans le liquide pendant que le bateau est renversé. Une fois que les pièces ne sont plus attachées au bateau, versez son contenu dans le tube. Ramassez les morceaux restants avec la pince et lavez-les dans le tube.

Après avoir centrifugé le tube à 931 fois la gravité à 4 degrés Celsius pendant deux minutes, utilisez une pipette de 5 millilitres pour éliminer le HBSS et toute graisse flottante. Ajouter 5 millilitres de collagénase diluée dans du HBSS. Fermez le tube et assurez-vous que le couvercle est scellé en enveloppant le tube dans un film de paraffine plastique. Placez-le dans un incubateur, en l’agitant à 220 tr/min à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, ce qui donnera une solution trouble et quelques morceaux de tissu restants.

Pour arrêter la dissociation, placez le tube sur de la glace et ajoutez 5 millilitres de HBSS froid avec 5 % de FBS. Après une centrifugation à 931 fois la gravité à 4 degrés Celsius pendant deux minutes, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 millilitres. Remettre la pastille en suspension dans 10 millilitres de HBSS avec 5 % de FBS et centrifuger à nouveau à 931 fois la gravité pendant deux minutes à 4 degrés Celsius.

Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 millilitres et répétez cette étape avec 10 millilitres supplémentaires de HBSS avec 5 % de FBS. Remettez ensuite en suspension le granulé dans 5 millilitres de HBSS avec 5 % de FBS. À l’aide d’une pipette P1000, filtrez la suspension cellulaire 1 millilitre à la fois à travers une maille de 500 micromètres dans un tube de 50 millilitres.

Pour laver toutes les cellules pancréatiques restantes à travers le maillage, ajoutez 5 millilitres supplémentaires de HBSS avec 5 % de FBS. Ensuite, à l’aide d’une pipette P1000, faites passer ce filtrat 1 millilitre à la fois à travers la maille de 105 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Pipetez doucement cette suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant du HBSS avec 30 % de FBS, qui formera une couche de suspension cellulaire au sommet.

Centrifugez cette suspension cellulaire à 233 fois la gravité à 4 degrés Celsius pendant deux minutes et retirez le surnageant. Remettez en suspension la pastille contenant les cellules acineuses dans le milieu complet de 1X Waymouth.